白藜蘆醇對(duì)阿爾茨海默病小鼠記憶能力及腦組織NOS和NO含量的影響

倪南珍，王 敏，林 茂，謝朝美，王春梅

(1. 珠海市金灣區(qū)婦幼保健院，廣東 珠海 519040；2. 遵義醫(yī)學(xué)院 珠海校區(qū)，廣東 珠海 519041)

白藜蘆醇 (resveratrol，Res) 俗稱芪三酚，是一種非黃酮類多酚類化合物。主要存在于葡萄、藜蘆、虎杖等植物中。研究發(fā)現(xiàn)，Res具抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等廣泛的生物學(xué)活性[1-3]。目前，白藜蘆醇的神經(jīng)保護(hù)作用頗受關(guān)注，研究證實(shí)Res對(duì)阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)小鼠認(rèn)知功能具有一定保護(hù)作用，并能改善AD小鼠的抗氧化能力[4]。一氧化氮(nitric oxide, NO) 是一個(gè)分子量小、難溶于水的脂溶性氣體分子，其具有廣泛復(fù)雜的生理作用。機(jī)體內(nèi)NO的合成依賴于一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)。NOS大量激活，可以導(dǎo)致NO過(guò)量生成，繼而引起神經(jīng)毒性。研究發(fā)現(xiàn)，AD患者認(rèn)知功能損害程度與體內(nèi)NO水平密切相關(guān)[5]。本研究采用D -半乳糖和氯化鋁聯(lián)合的方法構(gòu)建AD小鼠模型，觀察Res對(duì)AD小鼠記憶能力及腦組織NOS和NO含量的影響，初步探討Res防治AD的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 50只健康昆明雌性小鼠，SPF級(jí)，體重(30±3)g，廣州醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK(粵)2003-0002。D-半乳糖購(gòu)自Sigma公司，批號(hào)：106K0045。Res(純度≥98%)購(gòu)自湖南洪江華光生物有限責(zé)任公司，批號(hào)：080130。結(jié)晶氯化鋁分析純購(gòu)自廣州化學(xué)制劑廠，批號(hào)：20060501。NO測(cè)定試劑盒、NOS測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。DAB顯色試劑盒、兔抗鼠神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)多克隆抗體、SABC二抗試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。RT-1904C生化分析儀，深圳雷杜科技有限公司。STT-2小鼠跳臺(tái)儀，北京醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所。UV-7501紫外分光光度計(jì)，無(wú)錫科達(dá)儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 模型構(gòu)建及分組給藥 50只SPF級(jí)健康雌性昆明小鼠，體重(30±3)g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組、AD模型組、Res低劑量組、Res中劑量組和Res高劑量組，每組10只。除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠每天灌胃三氯化鋁10 mg/kg和腹腔注射D-半乳糖120 mg/kg，連續(xù)90d，構(gòu)建AD模型。Res干預(yù)各組小鼠從第31天起，在上述基礎(chǔ)上再每天分別給予22 mg/kg、44 mg/kg、88 mg/kg的Res灌胃，連續(xù)60 d。

1.2.2 跳臺(tái)法測(cè)定小鼠記憶能力 末次給藥結(jié)束2 h后，進(jìn)行跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)測(cè)定小鼠記憶能力。跳臺(tái)儀器為底面鋪有銅柵的實(shí)驗(yàn)箱，銅柵上置1個(gè)圓柱形橡膠絕緣臺(tái)作為回避電擊的安全區(qū)。先讓小鼠在實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)適應(yīng)環(huán)境5 min，然后給銅柵通電，小鼠受到電擊后，正常反應(yīng)為跳上絕緣臺(tái)來(lái)逃避電擊，記錄小鼠5 min內(nèi)遭受的電擊次數(shù)作為學(xué)習(xí)成績(jī)。休息24 h后，將小鼠直接置于跳臺(tái)上，記錄其在跳臺(tái)上的停留時(shí)間即潛伏期和5 min內(nèi)雙足同時(shí)接觸銅柵觸電的次數(shù)即錯(cuò)誤次數(shù)。

1.2.3 腦組織中NOS和NO含量測(cè)定 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，迅速斷頭取腦，清理血跡，稱重，加入9倍4 ℃無(wú)菌的生理鹽水，制成10%腦組織勻漿，2500 r/min離心10 min，取上清液。嚴(yán)格按照生化試劑盒說(shuō)明操作，檢測(cè)腦組織內(nèi)總NOS，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)和結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶(constitutive nitric oxide synthase, cNOS)活力以及NO的含量。

1.2.4 免疫組化法測(cè)定大腦皮層nNOS的表達(dá) 在4%的多聚甲醛中固定鼠腦24 h，人字點(diǎn)前3 mm處冠狀面取材，然后進(jìn)行石蠟包埋、切片(4 μm/片)。常規(guī)脫蠟至水，微波修復(fù)抗原。采用SABC法免疫組化染色，DAB 顯色，Mary’s蘇木素復(fù)染。陰性對(duì)照片用PBS 代替一抗。在nNOS表達(dá)部位顯示為和背景有差別的棕黃色顆粒，判定為陽(yáng)性，并測(cè)定灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠記憶能力變化 各組小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(見(jiàn)表1)，與正常對(duì)照組相比較，AD模型組小鼠的學(xué)習(xí)成績(jī)下降，潛伏期減短，錯(cuò)誤次數(shù)增多(P<0.01)。與AD模型組相比較，不同劑量Res干預(yù)組小鼠學(xué)習(xí)成績(jī)有所提高，潛伏期增長(zhǎng)，錯(cuò)誤次數(shù)減少(P<0.05)。

分組學(xué)習(xí)成績(jī)(次)潛伏期(S)錯(cuò)誤次數(shù)(次)正常對(duì)照組0．70±0．31273．63±57．620．43±0．53 AD模型組2．30±0．39?61．47±35．46?1．91±0．69? Res低劑量組0．89±0．51#152．33±51．83#1．09±0．52# Res中劑量組0．95±0．44#259．31±54．61#0．88±0．83# Res高劑量組0．82±0．38#154．50±57．21#0．95±0．57#

注：與正常對(duì)照組比較*P<0.01，與AD模型組比較#P<0.05。

2.2 各組小鼠腦組織中NO的含量變化 生化試劑盒檢測(cè)的各組小鼠腦組織NO的含量變化(見(jiàn)表2)。與正常對(duì)照組相比較，AD模型組小鼠NO的含量增多(P<0.01)。與AD模型組比較，Res干預(yù)各劑量組NO含量下降，其中Res中、高劑量組小鼠腦組織中NO含量下降明顯(P<0.05)。

分組NO正常對(duì)照組0．87±0．36 AD模型組1．52±0．43? Res低劑量組1．30±0．47 Res中劑量組1．01±0．42# Res高劑量組0．91±0．33#

注：與正常對(duì)照組比較*P<0.01，與AD模型組比較#P<0.05。

2.3 腦組織中NOS活力變化 生化試劑盒檢測(cè)到各組小鼠腦組織NOS活力變化(見(jiàn)表3)。與正常對(duì)照組相比較，AD模型組的小鼠總NOS和cNOS活力均有所升高(P<0.01)。與AD模型組比較，Res干預(yù)的各組小鼠腦總NOS和cNOS活性均有所下降，其中Res高劑量組cNOS活性下降明顯，Res中、高劑量組總NOS下降明顯(P<0.05)。而各組小鼠iNOS活力未見(jiàn)差異(P>0.05)。

2.4 大腦皮質(zhì)中nNOS表達(dá)變化 免疫組化染色顯示(見(jiàn)圖1)，nNOS在腦神經(jīng)元胞漿內(nèi)呈棕黃色強(qiáng)陽(yáng)性著色，如“→”所示。正常對(duì)照組神經(jīng)元胞漿內(nèi)僅有少量的淡黃色陽(yáng)性顆粒。AD模型組神經(jīng)元胞漿染色呈棕黃色強(qiáng)陽(yáng)性。Res低劑量組神經(jīng)元胞漿染色較強(qiáng)，接近AD模型組，呈棕黃色。Res中劑量和高劑量組神經(jīng)元胞漿內(nèi)含有弱陽(yáng)性的淺棕黃色顆粒。陰性對(duì)照片神經(jīng)元胞核藍(lán)染，胞漿內(nèi)未發(fā)現(xiàn)有別于背景的陽(yáng)性染色?；叶戎捣治鲲@示(見(jiàn)表4)，與正常對(duì)照組相比較，AD模型組小鼠大腦皮質(zhì)nNOS表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01)。與AD模型組比較，Res干預(yù)各組小鼠大腦皮質(zhì)nNOS表達(dá)減弱，其中Res中、高劑量組下降明顯(P<0.05)。

分組NOSiNOScNOS正常對(duì)照組0．97±0．240．22±0．060．75±0．24 AD模型組1．81±0．29?0．21±0．101．61±0．27? Res低劑量組1．70±0．610．30±0．031．41±0．58# Res中劑量組1．54±0．280．26±0．141．31±0．32 Res高劑量組1．40±0．38#0．25±0．151．14±0．25##

注：與正常對(duì)照組比較*P<0.01，與AD模型組比較#P<0.05，##P<0.01。

注：A：陰性對(duì)照片；B：正常對(duì)照組；C：AD模型組；D：Res低劑量組；E：Res中劑量組、F：Res高劑量組。箭頭所指為陽(yáng)性染色顆粒。圖1 各組小鼠大腦皮質(zhì)nNOS表達(dá)(IHC×400)

分組平均灰度值正常對(duì)照組134．07±6．19 AD模型組95．79±8．01? Res低劑量組96．10±9．61 Res中劑量組118．45±10．28# Res高劑量組123．29±4．84#

注：與正常對(duì)照組比較*P<0.01，與AD模型組比較#P<0.05。

3 討論

AD是一種老年期以記憶和認(rèn)知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)退行性疾病?；颊吣X神經(jīng)細(xì)胞外出現(xiàn)β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein, Aβ)的沉積和機(jī)體內(nèi)的氧化損傷構(gòu)成了AD發(fā)病的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)[6-7]。而NO作為與之相關(guān)的物質(zhì)之一被密切關(guān)注[8]。研究發(fā)現(xiàn)，在AD患者體內(nèi)NO與Aβ沉積和氧化應(yīng)激正相關(guān)[8]。可見(jiàn)，改善NO含量可能成為治療AD的一個(gè)切入點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)前期工作已經(jīng)證實(shí)：Res可以改善AD小鼠的抗氧化能力，提高其記憶能力[4]。但是其對(duì)AD模型小鼠的作用機(jī)制是否與NO相關(guān)，還有待進(jìn)一步深入研究。

NOS作為催化機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性NO的唯一酶類，其活力高低與體內(nèi)NO表達(dá)正相關(guān)。NOS可分為iNOS、內(nèi)皮型NOS(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)和nNOS三種，其中eNOS和nNOS又可以合稱cNOS[9]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察不同類型的NOS活力，綜合分析Res干預(yù)NO生成的可能機(jī)制。

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