錳暴露工人XRCC1基因C26304T位點多態(tài)性與神經行為改變

姜 慧， 劉繼剛，繆雪陽，申旭波，周希雷，鄒 焰

(1.中國疾病預防控制中心 傳染病預防控制處，北京 102206； 2.遵義市紅花崗區(qū)人民醫(yī)院， 貴州 遵義 563000； 3.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563099； 4.遵義醫(yī)學院 公共衛(wèi)生學院，貴州 遵義 563099)

錳是人類在工業(yè)和日常生活中廣泛接觸的一種金屬，目前被認為是可能必需的人體微量元素，但攝入過量錳會造成全身多器官的危害，對大腦神經系統(tǒng)損傷最為嚴重，會造成神經系統(tǒng)永久性損失，甚至還會致癌、致畸、致突變[1-2]。據(jù)報道，過量錳會導致DNA鏈的斷裂，鏈間的交叉連接出現(xiàn)錯誤、DNA的合成抑制和非程序性DNA修復合成等DNA損傷的現(xiàn)象[3-5]，引起細胞及機體的異常改變。X射線修復交叉互補基因1(X-ray repair cross complementing group, XRCC1)是一種重要的DNA堿基切除修復基因，在DNA損傷修復反應中發(fā)揮重要作用[6-7]。據(jù)鄭玉新等[8]報道，在同樣的作業(yè)環(huán)境、同樣接觸水平的工人中，并不是所有的接觸者都發(fā)生相關損害，而僅有部分人發(fā)生，提示個體對錳損傷的敏感性和耐受性是有差異的。XRCC1作為DNA損傷修復基因，其多態(tài)性與錳接觸者的神經行為改變是否有關，目前尚未有報道。該研究主要探討XRCC1基因的各種多態(tài)與暴露于錳的工人神經行為改變的關系。

1 對象與方法

1.1 對象 研究人群包括200名工齡在半年以上的貴州省錳鐵合金廠冶煉工人，以及94名具相似勞動強度但環(huán)境中無錳暴露的貴州省硅鐵合金廠工人。根據(jù)各工種作業(yè)場所空氣錳濃度和工人接觸錳作業(yè)的工齡，計算各研究者的累積暴露指數(shù)(Cumulative exposure index, CEI)，CEI=C×T , C是指工作場所平均空氣錳濃度(mg/m3) , T是在C錳濃度下的作業(yè)工齡年。根據(jù)CEI將全部研究人群分為三組：高錳暴露組(CEI>0.4)；低錳暴露組(0.03

1.2 主要試劑和儀器 DNA提取試劑、PCR擴增試劑(天根生化科技北京有限公司)；限制性內切酶MspI(MBI公司，美國)；PCR擴增儀、凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD公司，美國)；便攜式個體空氣采樣器(SKC Inc，729861，美國)；空氣采樣流量校正儀(SENSIDYNE Inc，0501066-s，美國)；1.000 g/L錳溶液標準品(上海計量測試技術研究院)；火焰原子吸收儀(Varian，AA240FS，美國)；溝槽穩(wěn)定試驗測量儀(32010，美國普度大學)[9]；插板試驗測量儀(32020，美國普度大學)[10]。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集 研究人群佩戴空氣個體采樣器采集8 h工作場所的空氣樣本，采樣器的濾膜孔徑是PM2.50。同時采集其外周靜脈血5 mL，肝素抗凝。

1.3.2 樣品錳測定 先將空氣樣品用高氯酸和硝酸混合液(1∶9)消化至無色透明，置于電熱板上蒸干，再用1%硝酸定容至10 mL，上石墨爐火焰原子吸收儀測定空氣中錳濃度。

1.3.3 XRCC1基因多態(tài)性分析 DNA提取采用常規(guī)酚—氯仿法，基因多態(tài)性分析采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法。人XRCC1基因DNA序列及C26304T位點信息從NCBI基因庫獲取，引物采用Primer premier 5.0軟件設計，上游引物序列為5’-GCCCCGTCCCAGGTA-3’，下游引物序列為5'-AGCCCCAAGACCCTTTCACT-3’(上海捷瑞生物工程公司合成)。PCR反應體系是25 μL，ddH2O加入15.7 μL，PCR MasterMix加入 5.8μL，上下游引物各加入1 μL，DNA模板加入1.5 μL。PCR反應條件為：預變性95 ℃5 min；變性95 ℃1 min，退火58 ℃50 s，延伸72 ℃50 s，共35個循環(huán)；最后延伸72 ℃10 min。酶切體系是20 μL，ddH2O加入11 μL，10×buffer加入2 μL，內切酶MspI加入10U，PCR產物加入6 μL，混勻后溫浴37 ℃3.5 h,然后水浴65 ℃15 min,使酶失活，酶切產物采用2%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照并判讀基因型。

1.4 神經行為檢測

1.4.1 溝槽穩(wěn)定試驗 將溝槽穩(wěn)定試驗測量儀放于被檢測者中央，然后進行劃痕長度和碰撞次數(shù)測定，被檢測者測試時不用任何方法支撐手或前臂，將測試筆由溝槽的最寬處向最窄處移動，檢測2次，讀取被檢測者第1次碰觸壁緣時的劃痕長度,將2次劃痕長度取其平均值；另計數(shù)從最寬處劃到27 cm處時碰撞邊緣次數(shù)， 取2次平均值。反映被試者眼手協(xié)調性和手穩(wěn)定性。

1.4.2 插板試驗 插板試驗反映手臂、手和手指整體運動協(xié)調性以及手指尖的靈巧性，是一個組合操作，器械包括1根針、2個墊圈、1個環(huán)。將試驗測試板放于被檢測者前面，組合順序是利手將針插入孔中，非利手再套1個墊圈在針上，利手又將1個環(huán)放在墊圈上，非利手再將另1個墊圈放在環(huán)上。針和空心環(huán)放在利手的一側，圈墊放在非利手的一側，練習2次后進行正式測試，測試時間60 s，記錄完成組合數(shù)量。每完成1個組合計為4分，未完成的組合按完成的部分加分，完成一個部分增加1分，計算總分。

2 結果

2.1 錳累積暴露指數(shù) 錳高暴露組研究人群的CEI為1.710±0.8438，錳低暴露組研究人群CEI為0.165±0.0974，對照組研究人群CEI為0.014±0.0088。

2.2 XRCC1 C26304T位點電泳結果 C26304T位點經PCR擴增后的產物長度為491bp(見圖1),由C→T突變使第194位密碼子由精氨酸(Arg)變?yōu)樯彼?Trp)，從而形成Arg194Trp多態(tài)性，MspI酶切后可出現(xiàn)313bp、292bp、178bp和21bp四個片段，其中野生純合型(Arg/Arg)為292bp、178bp和21bp三個片段；突變純合型(Trp/Trp)為313bp和178bp兩個片段；雜合型(Arg/Trp)為313bp、292bp、178bp和21bp四個片段(見圖2)。

注：M: 100bp DNA Ladder; 2,3,6,11: Arg/Arg基因型；1,4,7,10：Arg/Trp基因型; 5,8,9,12: Trp/Trp基因型。圖2 XRCC1 C26304T 位點各基因型酶切產物瓊脂糖凝膠電泳圖象

2.3 神經行為檢測改變和基因多態(tài)性的關系

2.3.1 工人基本情況 三組研究人群的年齡、文化水平、性別之間無差異(P>0.05)，見表1。

2.3.2 神經行為檢測結果 高、低暴露組中的 XRCC1 C26304T 位點各基因型在垂直溝槽穩(wěn)定試驗的劃痕長度檢測、碰撞次數(shù)檢測和插板試驗得分三指標都有差異(P<0.05)，高暴露組的劃痕長度和插板試驗得分低于低暴露組，而碰撞次數(shù)多于低暴露組；并且攜帶突變基因型的研究人群其劃痕長度、插板試驗得分均低于攜帶野生基因型和雜合基因型的研究人群，碰撞次數(shù)高于野生基因型和雜合基因型(P<0.05)，對照組內各基因型無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，見表2。

表1三組研究人群基本情況

組別基因分型例數(shù)(%)年齡(x±s，歲)文化水平(x±s，年)性別(男/女)高暴露組CC34(33．7)34．847±6．0297．870±1．90428/6CT59(58．4)33．833±6．3537．426±3．55350/9TT8(7．9)31．000±8．6928．200±2．5307/1低暴露組CC22(22．2)33．415±7．17210．396±3．46013/9CT62(62．6)36．309±6．94610．181±3．01947/15TT15(15．2)34．167±7．1059．167±4．99711/4對照組CC34(36．2)36．961±5．8277．923±2．01824/10CT53(56．4)36．447±7．6388．277±1．76644/9TT7(7．4)38．900±8．0458．150±2．8156/1

注：CC為純合型，CT為雜合型，TT為突變型。

表2 XRCC1 C26304T位點各基因型與神經行為改變的比較

名稱基因分型劃痕長度(cm)碰撞次數(shù)(次)插板試驗(分數(shù))高暴露組CC25．038±0．387?△1．916±0．307?△32．930±0．742?△ CT21．920±0．352?3．981±0．280?28．550±0．675? TT19．235±0．8235．532±0．65425．049±1．577 低暴露組CC26．203±0．239?△1．658±0．268?△34．216±0．768?△ CT23．096±0．231?3．143±0．249?30．788±0．713? TT20．914±0．7234．995±0．81025．730±2．319 對照組CC26．537±0．4631．969±0．43234．262±1．044 CT25．483±0．3382．543±0．31533．355±0．762 TT25．291±0．4742．947±0．44331．637±1．070

注：*代表CC、CT與TT之間的差異比較，P<0.05;△代表CC子與CT之間的差異比較，P<0.05。

3 討論

XRCC1基因是一種重要的DNA堿基切除修復基因，定位于人類19號染色體長臂區(qū)(19q13.2-19q13.3)，其基因組大小約33kb，包含17個外顯子，編碼633個氨基酸，相對分子量69.5kD。其編碼的蛋白可直接與DNA修復機制中的相關酶相結合形成復合體，在DNA損傷修復反應中主要參與因電離輻射和氧化損傷引起的堿基切除修復(BER)和單鏈斷裂修復[2-4 ,6-7]。

據(jù)樊衛(wèi)平等[11]的報道，過量錳進入機體后能作用于DNA和RNA，直接引起它們的損傷。給小鼠腹腔注射低劑量(10mg/kg)氯化錳，DNA鏈斷裂顯著增加，隨著劑量的增加，DNA損傷越嚴重，提示錳可作為誘變劑造成DNA損傷，其作用機制可能是高濃度的Mn2+[12]引起的。

鑒于錳中毒晚期表現(xiàn)為不可逆的進行性病變，篩選出早期錳損傷者和易感人群是錳毒性研究中所需要的。本實驗結果顯示，高、低暴露組中攜帶XRCC1 C26304T位點基因型的工人劃痕長度、碰撞次數(shù)、插板試驗之間是有差異的，并且這個位點突變基因型工人的劃痕長度、插板試驗得分均低于攜帶野生基因型和雜合基因型的工人，碰撞次數(shù)高于野生型和雜合型。而對照組內各基因型無差異，提示暴露在較高錳環(huán)境中，攜帶突變基因型的工人更易發(fā)生錳對神經行為的改變，這也可能為鄭玉新等觀察到的職業(yè)性錳接觸者在同樣的作業(yè)環(huán)境中，同等接觸水平的工人僅有一部分人才發(fā)生錳損傷[8]的現(xiàn)象提供了一定的解釋依據(jù)。這也為將來進一步追蹤研究不同XRCC1位點基因型接觸工人的錳損害提供了基礎數(shù)據(jù)。

XRCC1基因不僅與錳所致神經損害有關，還與其它一些慢性病如慢性阻塞性肺炎、肺癌、喉癌等的發(fā)生有關[13-16]，這也提示我們以后的研究還可擴大范圍，觀察其與錳對相關疾病的影響。

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