FQ-PCR溶解曲線技術(shù)分析白血病患者PBMC中T細(xì)胞TCRα/βCDR3譜系特征

孫永蘋，石 彬，朱紅倩，湯賢英，馬 銳， 姚新生

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 第二臨床學(xué)院，廣東 珠海 519100；3.貴州省人民醫(yī)院 血液內(nèi)科，貴州 貴陽 550002)

白血病(leukemia)是一種造血系統(tǒng)的惡性疾病，其特征是一系列白細(xì)胞及其幼稚細(xì)胞(即白血病細(xì)胞)在骨髓或其他造血組織中呈異常增生，使正常血細(xì)胞生成減少。其中，T細(xì)胞白血病，是T細(xì)胞在分化發(fā)育過程中出現(xiàn)異常，產(chǎn)生的腫瘤性增生。我國(guó)白血病的發(fā)病率較高，為3～4人/10萬人，近年來由于環(huán)境污染等因素的影響，其發(fā)病率有上升趨勢(shì)。T細(xì)胞的TCR CDR3 在T細(xì)胞白血病的發(fā)病機(jī)制、殘余病變的診斷、個(gè)體化治療等方面有一定的應(yīng)用，TCR克隆性重排的檢測(cè)在成熟T淋巴細(xì)胞白血病的診斷和治療中有著較為廣泛的應(yīng)用。目前，已證實(shí)T細(xì)胞白血病和非T細(xì)胞白血病，外周血T細(xì)胞α鏈和β鏈TCR CDR3譜系均存在克隆性(或寡克隆性)增殖(或稱為偏向取用)[1-3]。

TCR CDR3譜系的早期分析技術(shù)有PCR-DNA印跡，PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性等，目前主要采用毛細(xì)管電泳激光掃描分析技術(shù)，首先PCR擴(kuò)增CDR3區(qū)，然后根據(jù)引物的熒光標(biāo)記，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳激光掃描分析CDR3的長(zhǎng)度和特征(CDR3 spectratyping)[4-5]，這種技術(shù)不適合對(duì)較大臨床樣本的分析，自2009年開始，我們建立了FQ-PCR溶解曲線技術(shù)分析TCR CDR3譜系[6-7]，并在臨床腫瘤和感染等疾病中應(yīng)用[8-11]。

本研究在前期研究的基礎(chǔ)上[3]，采用FQ-PCR溶解曲線技術(shù)分析臨床白血病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中T細(xì)胞TRAV和TRBV基因各家族的CDR3譜系特征，為T細(xì)胞白血病和非T細(xì)胞白血病的發(fā)病機(jī)制、機(jī)體免疫應(yīng)答機(jī)制及個(gè)體化治療等研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本與試劑 經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)，組織化學(xué)等診斷為白血病患者15例(其中6例由遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液內(nèi)科提供，9例由貴州省人民醫(yī)院提供)，患者臨床資料(見表1)，4例健康志愿者(均為女性，年齡分別為32、26、28、28歲)外周血標(biāo)本由本實(shí)驗(yàn)室健康人提供作為對(duì)照。

mRNA提取試劑盒(TIANGENG公司), cDNA合成kit(MBI, Fermentas公司), Realtime PCR Master Mix(TOYOBO公司)等。

表1白血病患者基本資料

患者性別年齡(歲)診斷P1(Patient-1)女22急性T淋巴細(xì)胞白血病P2(Patient-2)男37急性淋巴細(xì)胞白血病P3(Patient-3)男16急性淋巴細(xì)胞白血病P4(Patient-4)男30急性淋巴細(xì)胞白血病P5(Patient-5)男29急性早前B淋巴細(xì)胞白血病P6(Patient-6)男23急性淋巴細(xì)胞白血病P7(Patient-7)女28淋巴瘤性白血病P8(Patient-8)女15淋巴瘤性白血病P9(Patient-3)女28淋巴瘤性白血病P10(Patient-9)男31何杰金氏淋巴瘤P11(Patient-10)男63多發(fā)性骨髓瘤P12(Patient-11)男55多發(fā)性骨髓瘤P13(Patient-13)男27急性髓性白血病P14(Patient-14)男70急性髓性白血病P15(Patient-15)女45慢性粒細(xì)胞性白血病

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 引物參照文獻(xiàn)[6-7]合成，合成人32個(gè)TRAV基因家族上游引物(共34條)，1條共同的TRAC下游引物；合成人24個(gè)TRBV基因家族上游引物(共26條)，及1條共同的TRBC下游引物；作為對(duì)照的GAPDH上游及下游引物，上述所有引物均由Invitrogen(上海英駿)生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 mRNA提取和cDNA合成 按照mRNA提取試劑盒操作說明進(jìn)行操作，提取JEC細(xì)胞及4例健康志愿者和15例白血病患者外周血中的mRNA，按cDNA合成kit條件，用OligodT作引物擴(kuò)增cDNA(每個(gè)樣本合成4個(gè)反應(yīng)管，每管20 μL)。

1.4 FQ-PCR擴(kuò)增TCRVα和TCRVβ各家族CDR3區(qū)段的cDNA

1.4.1 FQ-PCR擴(kuò)增TCRVα34個(gè)家族CDR3區(qū)段的cDNA FQ-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：每個(gè)樣本做36個(gè)PCR反應(yīng)管，1～34管為樣本反應(yīng)管，35管為GAPDH對(duì)照管，36管為無引物對(duì)照管；第1至34管分別加入TRAV1至TRAV32(期中TRAV1和TRAV4各有2個(gè)亞家族)上游引物1 μL，1～34管每管加入TRAC下游引物1 μL，第35管加GAPDH上、下游引物；1～35管分別加樣品cDNA 1 μL，1～36管每管加入熒光定量Mix 10 μL、純水7 μL(第36管加入9 μL純水)，總體積20 μL。選取JEC細(xì)胞株GAPDH相對(duì)表達(dá)量作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

FQ-PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：①擴(kuò)增：94℃ 3min,1 cycles; 94℃ 30sec, 55℃ 30sec,72℃ 50sec,45cycles;72℃ 10min,1cycles；②溶解曲線分析：75℃～95℃以0.2℃/S讀取1個(gè)熒光值，100cycles；③FQ-PCR產(chǎn)物取8 μL做1.5%瓊脂糖凝膠電泳，其余樣本-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 FQ-PCR擴(kuò)增TCRVβ 26家族CDR3區(qū)段cDNA FQ-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：樣本共做28個(gè)反應(yīng)管，1～26管為樣本反應(yīng)管，27管為GAPDH對(duì)照管，28管為無引物對(duì)照管；第1～26管分別加入TRBV1至TRBV24(期中TRBV5和TRBV13各有兩個(gè)亞家族)上游引物各1 μL，1～26管每管再加入TRBC下游引物1 μL；第27管加GAPDH上、下游引物各1 μL；1～27管每管再加入樣品cDNA1 μL； 1～28管每管加入熒光定量Mix 10 μL、純水7 μL(第28管加入9 μL純水)，總體積20 μL。選取JEC細(xì)胞株GAPDH相對(duì)表達(dá)量作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

FQ-PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：①擴(kuò)增：94 ℃ 3min, 1 cycles; 94 ℃ 30sec, 55 ℃ 30sec, 72 ℃ 50sec, 45 cycles; 72 ℃ 10min,1 cycles；②溶解曲線分析：75 ℃～95 ℃以0.2 ℃/S讀取一個(gè)熒光值，100 cycles；③FQ-PCR產(chǎn)物取8 μL做1.5%瓊脂糖凝膠電泳，其余樣本-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 普通PCR擴(kuò)增 從TRAV、TRBV的FQ-PCR溶解曲線中選取單峰家族Patient1: TRAV16; Patient7: TRAV4.2; Patient8: TRAV15; Patient1: TRBV12; Patient1: TRBV17; Patient1: TRBV24; Patient3:TRBV21;Patient11: TRBV9，進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增。普通PCR反應(yīng)體系：取FQ-PCR產(chǎn)物1 μL，加入相應(yīng)的TRAV/TRBV上游引物2 μL(引物濃度均為10 mmol/L)和相應(yīng)TRAC/TRBC下游引物2 μL，加入Taq DNA Polymerase 0.25 μL,2mMdNTP 5 μL,10×Buffer with KCL,25mM MgCl23μL, DDW 30.75 μL；總反應(yīng)體積50 μL；普通PCR反應(yīng)條件：α鏈：①95 ℃ 2min,1 cycles; ②95 ℃ 30sec, 60 ℃ 1min,72 ℃ 1min,35 cycles; ③72 ℃ 10min,1cycles；β鏈：①94 ℃ 3min,1 cycles; ②94 ℃ 1min, 56 ℃ 1min,72 ℃ 1min,35 cycles; ③72 ℃ 10min,1cycles。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)普通瓊脂糖凝膠回收后送Invitrogen(上海英駿)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 4例健康志愿者和15例白血病患者外周血標(biāo)本34個(gè)TRAV家族和26個(gè)TRBV家族CDR3譜型FQ-PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳上，各家族CDR3在預(yù)測(cè)位置處顯示條帶(見圖1～4)。

2.2 4例健康志愿者外周血標(biāo)本中34個(gè)TRAV家族和26個(gè)TRBV家族FQ-PCR CDR3譜型的溶解曲線圖顯示為多峰型圖和寡峰型圖；白血病患者外周血34個(gè)TRAV家族和26個(gè)TRBV家族FQ-PCR CDR3譜型溶解曲線圖多數(shù)患者出現(xiàn)寡或偏峰型圖、低或無峰型圖、少數(shù)患者出現(xiàn)典型的單峰型圖(見圖5～10)。

2.3 15例白血病患者中TRAV和TRBV單峰家族CDR3區(qū)測(cè)序的基因及氨基酸的組成不同(見表2、表3)。

注：其他健康志愿者TRAV家族電泳圖未列出。圖1 健康志愿者-1外周血αβT淋巴細(xì)胞34個(gè)TRAV家族和GAPDH對(duì)應(yīng)的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳圖

注：其他患者TRAV家族電泳圖未列出。圖2 白血病患者-1 外周血αβT淋巴細(xì)胞34個(gè)TRAV家族的CDR3和GAPDH分析的RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

注：其他健康志愿者TRBV家族電泳圖未列出。圖3 健康志愿者-1外周血αβ T淋巴細(xì)胞TCR 26個(gè)TRBV家族和GAPDH對(duì)照分析的RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

注：其他患者TRBV家族電泳圖未列出。圖4 白血病患者-1外周血αβ T淋巴細(xì)胞TCR 26個(gè)TRBV家族的和GAPDH對(duì)照分析的RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

注：其他健康志愿者α鏈FQ-PCR溶解曲線圖未列出。圖5 健康志愿者-1α鏈FQ-PCR溶解曲線圖

注：其他患者α鏈FQ-PCR溶解曲線圖未列出。圖6 白血病患者-1外周血αβ T淋巴細(xì)胞α鏈FQ-PCR溶解曲線圖

注：其他健康志愿者β鏈FQ-PCR溶解曲線圖未列出。圖7 健康志愿者-1外周血αβ T淋巴細(xì)胞β鏈FQ-PCR溶解曲線圖

注：其他患者β鏈FQ-PCR溶解曲線圖未列出。圖8 白血病患者-1外周血αβ T淋巴細(xì)胞β鏈FQ-PCR溶解曲線圖

圖9 白血病患者PBMC TRAV單峰家族CDR3的溶解曲線圖

圖10 白血病患者PBMC TRBV單峰家族CDR3的溶解曲線圖

表2 15例白血病患者外周血αβ T淋巴細(xì)胞TRAV單峰家族CDR3區(qū)序列分析

表3 15例白血病患者外周血αβ T淋巴細(xì)胞TRBV單峰家族CDR3區(qū)序列分析

表4 15例白血病患者TRAV單峰型家族、寡或偏峰型家族、低或無峰型家族統(tǒng)計(jì)表

患者單峰寡/偏鋒低峰/無峰 異常率P1-PBMCAV16AV15AV16無8．82%P2-PBMC無AV14AV18AV25AV3011．76%P3-PBMC無AV28AV275．88%P4-PBMC無AV29AV30無5．88%P5-PBMC無AV4．2AV10AV17AV25無11．76%P6-PBMC無AV4．2AV10AV22AV29無11．76%P7-PBMCAV4．2AV10AV8AV11AV18AV3214．70%P8-PBMCAV15AV2AV4．1AV5AV11AV13AV21AV27AV3026．47%P9-PBMC無AV1．1AV6無5．88%P10-PBMC無AV1．2AV17AV278．82%P11-PBMC無AV1．1AV10AV24無8．82%P12-PBMC無AV4．1AV12無5．88%P13-PBMC無AV3AV15無5．88%P14-PBMC無AV1．1AV7AV31無8．82%P15-PBMC無AV15AV17無5．88%

表5 15例白血病患者TRBV單峰型家族、寡或偏峰型家族、低或無峰型家族統(tǒng)計(jì)表

患者單峰寡/偏鋒低/無峰異常率P1-PBMCBV12BV17BV24BV5．1BV8BV13．1BV15BV19無30．77%P2-PBMC無AV3無3．85%P3-PBMCBV21BV3BV14BV19BV24無19．23%P4-PBMC無BV5．2無3．85%P5-PBMC無BV2BV7BV10BV15無15．38%P6-PBMC無無無無P7-PBMC無BV13．1BV21BV1111．54%P8-PBMC無BV22BV5．1BV1111．54%P9-PBMC無BV3BV16無7．69%P10-PBMC無BV12BV13．2BV14BV18BV21無19．23%P11-PBMCBV9BV5．1BV5．2BV20無15．38%P12-PBMC無無無無P13-PBMC無BV3BV13．1無7．69%P14-PBMC無BV3BV9BV2311．54%P15-PBMC無無無無

2.4 15例白血病患者中TRAV和TRBV單峰型家族、寡或偏峰型家族、低或無峰型家族出現(xiàn)不同程度的異常(見表4、表5)。

3 討論

TCR是在胚系基因的基礎(chǔ)上，在胸腺中進(jìn)行V、(D)、J、C的發(fā)育成熟，后遷移至外周形成了應(yīng)答T細(xì)胞庫(kù)，TCR是T細(xì)胞識(shí)別抗原的功能單位，屬免疫球蛋白超家族，其編碼鏈包括有α、β、γ和δ 4種多態(tài)鏈，外周血95%的TCR是由α、β兩條多態(tài)鏈構(gòu)成的異源性二聚體，α鏈由胚系基因中TRAV、TRAJ、TRAC重排組成，β鏈由胚系基因中的TRBV、TRBD、TRBJ、TRBC重排組成，不同V(D)J基因的重組以及重組時(shí)V-J(或V-D和D-J)之間隨機(jī)插入不同數(shù)量的核苷酸(互補(bǔ)決定區(qū)3：CDR3)，形成個(gè)體的多樣性的T細(xì)胞CDR3譜系[12-13]。T細(xì)胞CDR3譜系組成和特征在感染、腫瘤、自身免疫病等的研究中被廣泛應(yīng)用[14]。我們?cè)谇捌谘芯恐?，發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞白血病和彌漫性大B淋巴細(xì)胞瘤外周血存在TRAV和TRBV 的偏向取用[15]。其他白血病患者TRAV和TRBV家族偏向取用也有較多的報(bào)道：急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL): TCR AV3, TCR AV6, TCR AV10, TCR AV26, TCR AV27以及TCR BV23家族[16]；急性粒細(xì)胞白血病(acute myeloid leukemia, AML): TCR AV3, TCR AV12家族[17]；慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML): TCR AV1, TCR AV2, TCR AV4, TCR AV5, TCR AV8, TCR AV10, TCR AV12, TCR AV13, TCR AV16, TCR AV18, TCR AV19, TCR AV21以及TCR BV17, TCR BV21家族出現(xiàn)單/寡克隆性增殖等[18-19]。

本實(shí)驗(yàn)采用FQ-PCR溶解曲線技術(shù)，分析15例臨床白血病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中T細(xì)胞TRAV和TRBV基因各家族的CDR3譜系特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4例健康志愿者外周血αβT細(xì)胞中TRAV基因和TRBV基因各家族CDR3的FQ-PCR溶解曲線圖，均表現(xiàn)為多峰圖；而15例白血病患者外周血αβT細(xì)胞中TRAV基因和TRBV基因各家族CDR3的FQ-PCR溶解曲線圖，表現(xiàn)為多峰圖、單峰圖、寡/偏峰圖、低/無峰圖，其中，F(xiàn)Q-PCR溶解曲線圖顯示的單峰、寡/偏峰家族，提示T細(xì)胞的克隆性增殖，對(duì)于非T細(xì)胞白血病而言，可能是由機(jī)體正常T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞應(yīng)答，而產(chǎn)生的克隆性增殖，這種克隆性增殖可能在白血病患者的抗腫瘤應(yīng)答中起重要作用；對(duì)于T細(xì)胞白血病而言，多數(shù)文獻(xiàn)認(rèn)為是腫瘤性T細(xì)胞，但是同其他腫瘤一樣，機(jī)體的正?？鼓[瘤T細(xì)胞也可以出現(xiàn)克隆性增殖。FQ-PCR溶解曲線圖顯示的低/無峰家族可能是由機(jī)體免疫功能缺陷造成的，也可能是患者存在其它家族T細(xì)胞的大量克隆性增殖而抑制了極低峰家族的表達(dá)而造成。分析不同白血病患者的偏向家族和文獻(xiàn)報(bào)道有相同的家族，亦有不同的家族。同時(shí)，不同白血病患者TRAV和TRBV家族異常峰比率不同，提示不同患者機(jī)體的免疫應(yīng)答狀態(tài)不一致。對(duì)單峰家族測(cè)序后TCR CDR3區(qū)基因序列、氨基酸序列不同，并未在TRAV或是TRBV克隆性增殖家族發(fā)現(xiàn)共同基序，故此，尚未發(fā)現(xiàn)存在白血病特異性基因序列，提示不同白血病患者腫瘤T和抗腫瘤T的多樣性和復(fù)雜性，同時(shí)，這些克隆性增殖家族的α鏈和β鏈的CDR3各家族是如何搭配的亦需要進(jìn)一步研究。

對(duì)于非T細(xì)胞白血病TRAV和TRBV克隆增殖性家族進(jìn)行進(jìn)一步研究，需要證實(shí)克隆增殖性家族是否具有抗腫瘤的特異性？能否作為特異性CTL細(xì)胞用于腫瘤的個(gè)體化過繼免疫治療？將為非T細(xì)胞白血病個(gè)體化治療提供新的手段。而對(duì)于T細(xì)胞白血病的TRAV和TRBV克隆增殖性家族是腫瘤T細(xì)胞還是應(yīng)答T細(xì)胞？若為腫瘤T細(xì)胞，是否具有抗原特異性？能否作為腫瘤治療的靶標(biāo)；若為應(yīng)答T細(xì)胞，是否具有抗腫瘤的特異性？這些問題的進(jìn)一步研究將為T細(xì)胞白血病發(fā)病機(jī)制等研究提供基礎(chǔ)。

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