骨髓間充質(zhì)干細胞移植增強大鼠子宮切口再生修復

陳志文，楊孝軍，張乾，朱華，胡燕

子宮創(chuàng)傷及后續(xù)妊娠時的瘢痕子宮破裂，是婦產(chǎn)科醫(yī)師仍待解決的一個難題。有效減少子宮切口的瘢痕愈合，增強局部肌細胞再生修復，恢復宮壁肌層的生物力學功能，可能是預防瘢痕子宮破裂的關(guān)鍵，而目前尚缺乏能增強子宮切口再生修復的有效方法。本研究擬在大鼠的子宮創(chuàng)傷模型中，運用骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）進行移植，觀察移植后MSCs在子宮切口內(nèi)，朝向肌層的定向分化情況及局部肌層的生物力學，以探討MSCs移植增強大鼠子宮創(chuàng)傷后再生修復的可行性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器 SPF級SD大鼠90只（其中60只雌鼠），體質(zhì)量250～300 g，周齡6～8周，購自溫州醫(yī)科大學實驗動物中心（動物實驗合格證號：SCXK-20020001）。本研究已獲溫州醫(yī)科大學實驗動物倫理道德委員會的批準。

兔抗大鼠血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）多克隆抗體，兔抗大鼠α-SMA多 克隆抗體，小鼠抗大鼠GFP單克隆抗體，CY3標記的羊抗兔二抗，相關(guān)S-P等免疫組織化學配套試劑盒，均購自武漢博士德生物工程有限公司。熒光顯微鏡型號TCS-SP2，德國LEICA公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 建立大鼠子宮創(chuàng)傷模型：所有SD大鼠同系自然交配，參照文獻[1]建立大鼠瘢痕子宮模型。于妊娠第19天行剖宮取胎術(shù)，小心移去仔鼠和胎盤，4-0可吸收薇喬線連續(xù)縫合子宮切口，術(shù)后2周觀察子宮切口的愈合情況，共制作60只子宮創(chuàng)傷雌鼠模型，隨機分為移植組與對照組（各30只）。

1.2.2 MSCs培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與移植：參照文獻[2]，采用密度梯度離心+貼壁培養(yǎng)的方法獲得大鼠MSCs，置DMEM細胞培養(yǎng)液中，傳至第四代，待細胞性狀穩(wěn)定時，與腺病毒-綠色熒光蛋白（Ad-GFP）共同培養(yǎng)：按每瓶1×105mL-1將MSCs接種在25 cm2培養(yǎng)瓶中，1 d后絕大部分細胞貼壁，將感染復數(shù)為100的Ad-GFP 加入培養(yǎng)瓶。6～8 h后棄去培養(yǎng)基，重新?lián)Q液，繼續(xù)培養(yǎng)至MSCs鋪滿瓶底，直至獲得Ad-GFP轉(zhuǎn)染后的MSCs。取子宮創(chuàng)傷雌鼠，再次原切口進腹，使用1 mL注射器在移植組大鼠子宮原切口兩側(cè)肌層內(nèi)直接多點注射Ad-GFP標記的第四代MSCs（2×105mL-1），每側(cè)約2×105個MSCs，對照組采用同樣方法注射等量PBS液。

1.2.3 移植后細胞因子的表達情況：MSCs移植后2周，取移植組及對照組各15只大鼠子宮切口肌層組織，行HE常規(guī)染色觀察瘢痕形成情況，再分別行VEGF（1:150）、TGF-β1（1:150）S-P免疫組織化學染色。兩種抗體均在細胞漿或細胞膜呈棕黃色表達，參照文獻[2]使用Image-pro Plus 6.0病理圖像分析系統(tǒng)，半定量分析陽性表達顆粒的平均吸光度值。

1.2.4 移植后MSCs的分化情況：Ad-GFP標記的MSCs移植后2周，大鼠子宮肌層組織行α-SMA抗體熒光染色，借助于Ad-GFP與α-SMA的雙重熒光顯色，檢測移植后MSCs在切口局部向平滑肌表型分化的情況。以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.5 子宮切口破裂閾值測量：移植組及對照組各15只大鼠，參照文獻[3]進行水壓彈性強度實驗，分別結(jié)扎雙側(cè)遠端子宮角，離原切口遠端1 cm處分別插入黃色24號留置針至宮腔，一端連接壓力表，另一端連接電子輸注泵，以3.5 mL/min穩(wěn)定持續(xù)輸注0.9%氯化鈉注射液，同時記錄壓力表上的瞬時壓力，直至壓力突然下降或看到水從切口流出，即為破裂閾值（mmHg）。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料用±s表示，采用成組設(shè)計的t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下的形態(tài)學改變 剖宮取胎術(shù)后2周取子宮瘢痕部位的肌層組織行HE染色，可見瘢痕組織生成明顯，間質(zhì)水腫及炎癥細胞浸潤（見圖1A），明顯不同于正常大鼠子宮肌層組織（見圖1B），確認瘢痕子宮動物模型成功建立。

圖1 大鼠瘢痕子宮肌層組織與正常子宮肌層組織（HE，×100）

2.2 免疫組織化學 移植組和對照組均有VEGF、TGF-β1蛋白的表達，兩種蛋白均在細胞漿及細胞膜中呈棕黃色表達（見圖2）。免疫組織化學圖像半定量分析結(jié)果顯示，MSCs移植后VEGF表達上調(diào)（P＜0.01），TGF-β1表達下調(diào)（P＜0.01）（見表1）。

圖2 VEGF、TGF-β1免疫組織化學染色（×100）

表1 對照組和移植組VEGF、TGF-β1的表達（n=15， ±s）

2.3 免疫熒光 MSCs移植后2周，從圖3可見，肌層組織仍有較強的Ad-GFP表達（綠色熒光帶），提示肌層局部MSCs存活良好。經(jīng)α-SMA抗體熒光染色（紅色）后，可見綠色的熒光區(qū)域，有大量片狀紅色細胞存在，Ad-GFP與α-SMA雙標陽性細胞數(shù)量較多，提示原位移植后的MSCs，在子宮肌層局部的微環(huán)境中，出現(xiàn)了平滑肌表型的定向分化。

2.4 子宮切口破裂閾值 經(jīng)水壓彈性實驗測量，移植組和對照組的的破裂閾值分別為（153.07± 21.37）mmHg和（137.11±19.71）mmHg，移植組較對照組顯著提高（P＜0.05），提示MSCs移植有效增強了子宮切口組織的破裂閾值。

圖3 MSCs移植后免疫熒光圖（×100）

3 討論

瘢痕子宮的處理歷來是困擾醫(yī)師的一個難題。目前對子宮創(chuàng)傷后修復與破裂的機制仍不甚明了。通常平滑肌細胞的再生能力差，子宮創(chuàng)傷后局部肌細胞受損，不足以完全再生修復受損的子宮肌層，只能通過纖維增殖形成彈性強度差、收縮功能差的瘢痕組織，導致子宮切口的瘢痕愈合，再次妊娠或分娩時可能會出現(xiàn)瘢痕子宮破裂[1]。

Bowers等[3]研究發(fā)現(xiàn)，通過醫(yī)源性手段，采用生長激素治療可提高大鼠瘢痕子宮切口處愈合的破裂強度，但仍無法確信是否能有效減少瘢痕子宮破裂的風險。Suzuki等[4]的研究提示光交聯(lián)殼聚糖可增強受損子宮肌層的瘢痕愈合。但目前尚缺乏能增強子宮創(chuàng)傷后肌層再生修復、組織重建與功能恢復的有效方法。

MSCs具備多胚層分化潛能，近年來MSCs已在腎臟、心肌、韌帶等組織的創(chuàng)傷中顯示了強大的修復功能，有望應(yīng)用于多種疾病的臨床治療[5]。如近年興起的MSCs移植修復梗死心肌，為治療缺血性心肌病提供了一種全新的治療手段[6]。最新研究表明MSCs可在體、內(nèi)外特定的組織微環(huán)境中被誘導分化為肌源性細胞[5]。另有研究[7-8]報道，MSCs能分化為具有收縮能力的平滑肌細胞。因此，植入MSCs修復子宮肌層創(chuàng)傷在理論上是可行的，但目前為止，將MSCs移植用于子宮創(chuàng)傷后肌層再生修復的研究鮮見報道。

本課題首次運用MSCs進行子宮切口內(nèi)原位移植，觀察到移植后MSCs在子宮肌層內(nèi)存活，并且出現(xiàn)朝向平滑肌細胞表型的定向分化，使得子宮創(chuàng)傷后的平滑肌再生愈合成為可能。MSCs移植后有效提高了子宮瘢痕處的破裂閾值，修復子宮壁肌層的生物力學功能。提示子宮切口內(nèi)MSCs移植，恢復了子宮切口局部組織結(jié)構(gòu)與生物力學功能的完整性。

既往研究顯示VEGF、TGF-β1與子宮創(chuàng)傷后修復、瘢痕破裂關(guān)系密切[9]。TGF-β1被認為與組織纖維化關(guān)系密切，可通過抑制間質(zhì)金屬蛋白酶，減弱間質(zhì)膠原的降解活動，加速纖維化過程[10]。本實驗中，MSCs移植后的子宮切口肌組織內(nèi)VEGF表達顯著增加的同時，伴隨TGF-β1表達的下降。我們分析，VEGF能誘導子宮瘢痕區(qū)域的上皮增殖和血管再生，有利于子宮創(chuàng)傷后的肌層再生修復，而MSCs移植后肌組織內(nèi)TGF-β1的降調(diào)，則促進了間質(zhì)膠原的降解活動，逆轉(zhuǎn)或抑制纖維化過程。提示MSCs移植可能通過干預諸多細胞因子的分泌來促進子宮肌層功能的修復。

總之，本研究初步證實了MSCs移植增強大鼠子宮創(chuàng)傷后再生修復的可行性，但仍需深入研究遠期療效及安全性等問題。最終有望實現(xiàn)子宮創(chuàng)傷后由瘢痕愈合向再生修復轉(zhuǎn)變，為干細胞移植用于子宮創(chuàng)傷的再生修復奠定基礎(chǔ)。