鼻咽癌復發(fā)的分子標志物Jab1 和Akt1 蛋白表達的差異*

王春華， 王蘇美， 徐 韜,2， 蘇箔金， 黃河澄， 楊惠玲△

(1中山大學中山醫(yī)學院病理生理學教研室，廣東 廣州 510080；2中山大學附屬佛山醫(yī)院，廣東 佛山 528000； 3中山大學附屬汕頭醫(yī)院, 廣東 汕頭 515031)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是流行于中國以及東南亞地區(qū)的一種發(fā)生于鼻咽上皮細胞的惡性腫瘤，在廣東省尤為高發(fā)[1]。目前放療和順鉑同步放療是原發(fā)鼻咽癌的標準治療方法[2]，然而經(jīng)標準治療后仍有10%～36%鼻咽癌患者出現(xiàn)鼻咽局部復發(fā)[3]。由于鼻咽癌復發(fā)的機制不清楚，鼻咽癌復發(fā)后的再治療難以取得滿意的療效[4]。之前許多文獻都是報道單個的腫瘤標志物與腫瘤的作用，而鼻咽腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個多步驟、多階段的過程，所以本文采用多個腫瘤標記物，希望能更深層次地探索其在腫瘤中的作用。在初發(fā)鼻咽癌中，Jab1是一個促瘤因素并已闡釋較為清楚[5]，但在復發(fā)鼻咽癌中的作用機制仍不清楚。Akt1在初發(fā)鼻咽癌中可以穩(wěn)定MDM2的表達，MDM2作為一種p53的負調控因子能下調p53的表達進而減少細胞凋亡[6]；而Akt1在復發(fā)鼻咽癌中機制不清。因而本實驗研究用免疫組織化學染色方法和Western blotting方法分別檢測鼻咽癌病人組織分子標志物的表達和鼻咽癌細胞在常態(tài)和電離輻射(ionizing radiation, IR)后蛋白表達的差異，希望能探明影響鼻咽癌復發(fā)的機制，為復發(fā)鼻咽癌預測和治療提供新標志物與靶點。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1細胞 高分化人鼻咽癌 CNE1和低分化鼻咽癌細胞株 CNE-2 來自中山大學腫瘤防治中心；低分化鼻咽癌 HONE1 細胞由美國俄亥俄州立大學 Ronald Glaser 教授提供;正常角質細胞 HOK16B 由 MD 安德森癌癥中心 Jeffrey N 教授提供;鼻咽癌輻射抗拒細胞株 CNE-2R[7]為本實驗室構建。

1.2取樣與病理診斷 篩查和選取中山大學附屬佛山醫(yī)院2003 年至2012 年和中山大學附屬汕頭醫(yī)院2001 年至2012 年同一鼻咽癌患者初發(fā)與復發(fā)癌組織石蠟標本25 對和20 對，并以廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院2006 年至2011 年正常人鼻咽組織石蠟標本40 例為正常對照。病例選取的條件包括：患者放療前均未行其它治療，放療前均有明確的病理學診斷；免疫組化實驗之前，HE 染色片請資深病理學教授再行確診為鼻咽癌，組織學分類明確；有完整的術后隨訪資料。所有組織標本來源及操作均符合醫(yī)學倫理標準。

1.3主要試劑 Jab1 鼠單抗購自Abcam；Akt1 兔單抗購自Cell Signaling Technology。小鼠IgG 和兔IgG 即用型SABC 免疫組化染色試劑盒、DAB 顯色試劑盒、Ⅰ抗稀釋液和蘇木素染液均購自武漢博士德生物工程有限公司；Western blotting Ⅱ抗為羊抗兔 IgG-HRP 和羊抗鼠IgG-HRP，均購自Santa Cruz。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng) 所有鼻咽癌細胞用含 10% 新生牛血清、青、鏈霉素的RPMI-1640 細胞培養(yǎng)基；HOK16B細胞多用培養(yǎng)基為角質形成細胞無血清培養(yǎng)基，使用前加入 30 mg/L bovine pituitary extract、0.2 μg/L EGF和5% FBS；細胞均置于 37 ℃、 5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

2.2Western blotting 法檢測細胞 Jab1 和 Akt1蛋白的表達 0 Gy 和10 Gy 電離輻射(ionizing radiation,IR)照射細胞，培養(yǎng) 24 h 后收集全細胞蛋白標本，常規(guī) BCA 方法蛋白定量。制備 15% 聚丙烯酰胺凝膠，進行 SDS-PAGE電泳(1.5～2 h)，轉移到 PVDF 膜(60 min)，室溫 5% BSA 封閉1 h，加Ⅰ抗(Jab1，1∶500；Akt1，1∶1 000；β -actin，1∶10 000)孵育 PVDF 膜 4 ℃過夜，TBST 洗膜 3 次，加Ⅱ抗孵育 60 min，TBST 洗膜 3 次， ECL 發(fā)光液顯色曝光， ImageJ軟件分析結果，以β-actin為內參照。

2.3免疫組化 采用免疫組織化學染色 SABC(spreptavidin-biotin-peroxidase complex)法檢測Jab1 和Akt1 在初發(fā)、復發(fā)鼻咽癌中的表達。實驗步驟如下：常規(guī)脫蠟水化，3% H2O2處理，滴加封閉液 20 min ，4 ℃條件下與Ⅰ抗(Jab1，1∶150；Akt1，1∶200)孵育過夜，次日滴加羊抗兔/羊抗小鼠 IgG，37 ℃孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB) 顯色，蘇木素復染。陰性對照以磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline， PBS)緩沖液代替Ⅰ抗。免疫組化結果判定，高倍鏡(×400)下隨機選取5 個視野，以胞核/漿黃染的細胞作為陽性表達的細胞，染色強度與陽性細胞百分比得分的乘積為每個視野的分值，5 個視野的平均分值即為最終結果。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。4種腫瘤標志物在初發(fā)NPC 和正常鼻咽組織表達差異采用卡方檢驗或Fisher 精確概率法，在復發(fā)NPC 和初發(fā)NPC 腫瘤標志物表達水平差異采用符號配對秩和檢驗(Wilcoxon signed-rank test)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 復發(fā)病人 NPC 組織和初發(fā) NPC 組織Jab1 表達比較

免疫組化檢測了45 例病人配對的復發(fā)與初發(fā)鼻咽癌組織Jab1 蛋白表達發(fā)現(xiàn)，陽性顆粒存在于胞核/胞漿中，見圖1。如表1所示，復發(fā)病人NPC 組織中，Jab1 蛋白細胞核陽性表達率93.02%(40/43)，細胞漿陽性表達率為97.67%(42/43)；初發(fā)NPC 組織細胞核陽性表達率為95.45%(42/44)，細胞漿陽性表達率為97.73%(43/44)。結果提示復發(fā)NPC 病人Jab1 核表達高于初發(fā)NPC 中Jab1 核表達(P<0.05) ， 兩者細胞漿之間的Jab1 表達無顯著差異。

2 復發(fā)病人 NPC 組織和初發(fā) NPC 組織Akt1表達比較

免疫組化檢測45 例病人配對的復發(fā)與初發(fā)鼻咽癌組織Akt1 蛋白表達發(fā)現(xiàn)，陽性顆粒存在于胞核和胞漿中，見圖2A、B。結果顯示(表2)，復發(fā)NPC 組織中，Akt1 蛋白細胞核陽性表達率83.72 %(36/43)，細胞漿陽性表達率為93.02 %(40/43)， 初發(fā)NPC 細胞核陽性表達率為74.42%(32/43)， 細胞漿陽性表達率為81.40%(35/43)。結果提示復發(fā)NPC 病人Akt1的核表達高于初發(fā)NPC 中Akt1的核表達 (P=0.01)； 兩者細胞漿之間的Akt1 表達無顯著差異。

Figure 1. The expression of Jab1 in NPC tissues (×200；×400 in the lower right). A: positive; B: negative.

表1 復發(fā)和初發(fā)NPC 組織中Jab1 蛋白陽性表達的比較

Figure 2. The expression of Akt1 in NPC tissues(×200；×400 in the lower right). A: positive; B: negative.

3 鼻咽癌細胞中Jab1 和Akt1 蛋白的表達

Western blotting法檢測CNE-1、 CNE-2、 CNE-2R 和 HONE1 鼻咽癌細胞以及 HOK16B正常角質細胞中Jab1 和Akt1 的蛋白表達，結果顯示(圖3)，以正常角質細胞HOK16B 中蛋白表達為基準，輻射抗拒CNE-1、CNE-2R 和HONE1 細胞中的Jab1 蛋白表達均高于輻射敏感CNE-2 細胞中的Jab1蛋白表達(P<0.01)；輻射抗拒CNE-1、CNE-2R 和HONE-1 細胞中的Akt1 蛋白表達均高于CNE-2 細胞中的Akt1 蛋白表達(P<0.01)。 結果提示輻射抗拒鼻咽癌細胞CNE-1、CNE-2R 和HONE1 中Jab1 和Akt1 蛋白表達均高于輻射敏感CNE-2 中Jab1 和Akt1 蛋白表達。

4 IR 對NPC 細胞Jab1 蛋白表達的影響

Western blotting法檢測CNE-1、 CNE-2、 CNE-2R 和 HONE1 細胞接受IR照射后Jab1 蛋白的表達，結果顯示(圖4)，CNE-1、 CNE-2R 和 HONE1 細胞接受10 Gy IR 照射后，Jab1 蛋白表達分別顯著高于未接受IR 照射的細胞中Jab1 蛋白表達(均P<0.01)；CNE-2細胞接受10 Gy IR 照射后，Jab1 蛋白表達也顯著高于未接受IR 照射的CNE-2 細胞中Jab1 蛋白表達(P<0.01)。結果提示IR促進CNE-1、 CNE-2、 CNE-2R 和 HONE1 細胞中的Jab1 過表達。

討 論

鼻咽癌是中國南方的高發(fā)癌癥，放療為其首選療法，雖經(jīng)過改良或與化療聯(lián)合應用，仍有20%左右鼻咽癌患者出現(xiàn)鼻咽局部復發(fā)，且大部分接受放療的患者均呈現(xiàn)輻射抗拒，進而加劇了NPC 的復發(fā)率。目前鼻咽癌復發(fā)機制不明了。故闡明其復發(fā)機制對于NPC 的治療至關重要。為此我們從分子標記物角度著手，欲探討復發(fā)與初發(fā)NPC 間差異表達的分子標記物及其與復發(fā)的相關機制。

我們通過免疫組織化學方法篩查了配對的復發(fā)與初發(fā)鼻咽癌組織中Jab1 和Akt1 蛋白的表達差異，發(fā)現(xiàn)在復發(fā)NPC中Jab1和Akt1核表達均高于初發(fā)NPC。為了進一步在細胞水平中驗證該結果，我們利用Western blotting法首先檢測同源不同輻射抗拒CNE-2R和CNE-2鼻咽癌細胞蛋白的表達差異后發(fā)現(xiàn)，Jab1和Akt1蛋白在的CNE-2R細胞中表達均高于其在CNE-2細胞中表達；再次檢測不同源不同輻射抗拒的CNE-1、HONE1 細胞與 CNE-2鼻咽癌細胞蛋白表達差異發(fā)現(xiàn)，Jab1 和Akt1 蛋白在CNE-1和HONE1細胞中表達均高于其在CNE-2 細胞中表達。本研究結果提示，Jab1 和Akt1 參與NPC 復發(fā)。本實驗室前期研究亦證實過表達的Jab1 促進鼻咽癌的發(fā)生[8]，Wu 等[9]發(fā)現(xiàn)過表達Akt1 能促進卵巢癌的發(fā)生，Simioni 等[10]發(fā)現(xiàn)Akt1 在復發(fā)肝癌中的高表達且提示不良預后。我們推測Jab1 和Akt1 表達增高促進鼻咽癌的復發(fā)。

表2 復發(fā)和初發(fā)NPC 組織中Akt1 蛋白陽性表達比較

Figure 3. The protein expression of Jab1 and Akt1 in CNE-1, CNE-2, CNE-2R, HONE1 and HOK16B (normal control) cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs CNE-2.

Figure 4. The protein expression of Jab1 in CNE-1, CNE-2, CNE-2R and HONE1 cells 24 h after 10 Gy of ionizing radiation (IR). Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs 0 Gy.

為了進一步探索放療與Jab1 和Akt1表達水平的關系以及Jab1 和Akt1表達水平與鼻咽癌復發(fā)的關系，我們從細胞水平入手，比較IR 照射前后鼻咽癌細胞株CNE-1、HONE1、CNE-2 與 CNE-2R，結果發(fā)現(xiàn)上述鼻咽癌細胞IR 照射后細胞中Jab1 的表達均高于IR 照射前的細胞。據(jù)文獻報道[11]，Akt 能通過磷酸化抑制核內p27 作用，Jab1 能將細胞核p27 帶入細胞漿中降解，核內p27 是一個促進細胞凋亡的因素，Jab1 和Akt1 的表達水平及活性能通過調控p27 表達進而影響細胞凋亡。本實驗室之前研究表明過表達的Jab1 通過促進p27 核漿轉位參與NPC 輻射抗拒，干預Jab1 可逆轉NPC 輻射抗拒，也可提高輻射抗拒NPC 細胞對化療的敏感性；NPC 放化療抗拒機制可能是通過PI3K-Akt 或Jab1 通路直接作用于p27，調控p27的表達、活性及定位，影響細胞周期和凋亡[12]。由此我們推測IR 照射可促進鼻咽癌細胞Jab1 和Akt1 的過表達，過表達Jab1 和Akt1 通過調控下游靶蛋白介導鼻咽癌細胞輻射抗拒，進而促進鼻咽癌復發(fā)，而下游靶蛋白是否為p27 或其它蛋白則有待進一步的實驗研究。

綜上所述，我們首次發(fā)現(xiàn)過表達Jab1 和Akt1 能介導鼻咽癌細胞的輻射抗拒進而促進鼻咽癌的復發(fā)。進一步檢測Jab1 和Akt1 介導鼻咽癌細胞輻射抗拒的下游信號通路有助于進一步闡明鼻咽癌復發(fā)的機制，并有望為復發(fā)鼻咽癌治療提供治療靶點。

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