母體肢體缺血預處理對宮內窘迫胎鼠復氧后海馬神經元凋亡的影響*

吳希珠， 鄭曉春， 陳小琳， 陳江湖， 李榮鋼， 鄭官林， 盧 歡

(1福建醫(yī)科大學省立臨床學院, 2福建省婦幼保健院麻醉科, 3福建省立醫(yī)院麻醉科，福建 福州 350001)

胎兒宮內窘迫常需要盡快結束妊娠來改善新生兒氧合，其缺氧/復氧過程存在缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)損傷，這也是新生兒缺氧缺血性腦病的主要病因。肢體缺血預處理(limb ischemia preconditioning，LIP)可通過機體內源性機制減輕遠隔臟器如心、腦、肺等的缺氧/復氧損傷[1-2]。本研究在胎兒宮內窘迫后，對孕鼠(母體)行LIP預處理，以胎鼠(子體)為研究目標，觀察母體LIP能否減輕宮內窘迫胎鼠娩出復氧后的中樞神經系統(tǒng)損傷。因凋亡相關Bcl-2家族成員通過線粒體途徑參與了細胞凋亡的調控，本實驗定性并定量研究了海馬CA1區(qū)促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，以期為臨床缺氧缺血性腦病的防治提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 動物

清潔級成年SD大鼠16只，其中雌性12只，雄性4只，體重250～280 g，由福建醫(yī)科大學實驗動物中心提供[實驗動物許可證號：SYXK(閩)2012-0002]。按雌3/雄1于前1 d晚合籠，次日晨8點陰道涂片檢查法確定交配后即可確定為孕 1 d，孕19 d時進行實驗。

2 模型構建

2.1胎鼠宮內窘迫(fetal distress，F(xiàn)D)模型構建 取孕19 d大鼠麻醉后下腹正中切開，暴露宮角，以無損傷小動脈夾于近子宮處鉗夾雙側子宮動靜脈和卵巢動靜脈，阻斷子宮胎盤血供致胎鼠宮內窘迫，15 min后松開動脈夾，將子宮還納入腹腔, 逐層縫合。

2.2LIP模型構建 以止血帶法在母體右側腹股溝處同側阻斷下肢血流(脈搏氧飽和度監(jiān)測)，阻斷/開放各5 min，循環(huán)3次進行母體LIP。

3 實驗分組

孕鼠按隨機數(shù)字表法分成4組?？瞻讓φ?sham,S)組：僅暴露通向子宮和卵巢的動靜脈但不阻斷；LIP組：于母鼠右下肢實施LIP，余同S組；FD組：阻斷子宮和卵巢的動靜脈15 min后松開；LIP +FD組：阻斷通向子宮和卵巢的動靜脈的同時，行母鼠右下肢LIP。

4 取材及標本處理

取材對象為胎鼠。孕鼠(母體)均多胎妊娠，實驗后48 h剖宮產，每只孕鼠隨機取活胎鼠4只，每組12只，均斷頭取全腦。每組取6只胎鼠視交叉后1 mm和4 mm處冠狀面切開，取中間塊固定、脫水、浸蠟、包埋后連續(xù)切片，片厚3 μm，取相鄰切片分別進行HE染色、TUNEL法凋亡細胞原位染色以及Bcl-2、Bax的免疫組化原位染色。每組另取6只胎鼠新鮮的海馬組織，Western blotting法檢測Bcl-2和Bax蛋白水平。

5 主要方法

5.1CA1區(qū)神經元的形態(tài)學觀察 HE染色，光鏡(×400)下觀察。

5.2CA1區(qū)凋亡神經元的檢測(TUNEL法) TUNEL凋亡試劑盒購自羅氏公司，參照試劑盒說明操作。光鏡(×400)下觀察胎鼠海馬CA1區(qū)神經元，選取5個不同視野，分辨TUNEL陽性細胞, 分別計算凋亡指數(shù)：陽性細胞數(shù)/(陽性細胞數(shù)+陰性細胞數(shù))×100%，取平均值。

5.3Bcl-2、Bax蛋白表達的免疫組化法檢測 試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。按試劑盒說明操作。在光鏡(×400)下觀察胎鼠海馬CA1神經元。

5.4Western blotting 檢測Bcl-2和Bax的蛋白表達 Ⅰ抗、Ⅱ抗購自北京中山金橋生物技術有限公司。在12%SDS-PAGE凝膠吸取待測樣品30 μg電泳，60 V積層膠30 min再100 V電泳分離蛋白。采用Trans-Blot轉印儀常規(guī)將蛋白轉印至PVDF膜，10%脫脂奶粉封閉后加入抗體(1∶300抗鼠Bcl-2或Bax)孵育1 h，過氧化物酶標記檢測抗原抗體復合物。自動電泳凝膠成像分析儀上分析結果。

6 統(tǒng)計學處理

各組凋亡細胞、凋亡指數(shù)均進行正態(tài)性檢驗，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析，方差齊采用LSD-t檢驗，方差不齊采用Dunnett’s檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0 統(tǒng)計學軟件處理。

結 果

1 HE染色結果

各組均可見海馬完整的橫切面結構，S組和LIP組細胞排列緊密，胞核大而圓，可見核仁；FD組和LIP+FD組海馬CA1區(qū)神經元排列較稀疏，部分細胞胞體縮小,見圖1。

Figure 1. Effects of maternal limb ischemic preconditioning (LIP) on CA1 hippocampal neurons in fetal rats (HE staining, ×400).S：sham; FD: fetal distress.

2 TUNEL染色結果

各組均見凋亡的神經元細胞，細胞核呈深棕色，染色質濃縮、邊緣化，核膜裂解，染色質分割成塊狀/凋亡小體,見圖2。與S組比較，F(xiàn)D組胎鼠海馬CA1區(qū)神經元凋亡指數(shù)增加(P<0.01)，LIP組胎鼠海馬CA1區(qū)神經元凋亡指數(shù)無明顯改變(P>0.05)，LIP+FD組凋亡指數(shù)增加(P<0.05)；與FD組比較，LIP+FD組細胞凋亡指數(shù)降低(P<0.05)，見表1。

Figure 2. The apoptotic hippocampal neurons in fetal rats detected by TUNEL assay (×400).S: sham;LIP:limb ischemic preconditioning;FD: fetal distress.

表1 母體LIP對胎鼠海馬神經元凋亡的影響

3 免疫組化法染色結果

在Bcl-2和Bax的免疫組化切片中，各組均可見胞漿陽性染色，呈棕褐色,見圖3、4。

4 Western blotting 檢測Bcl-2和Bax蛋白的表達

與S組比較，F(xiàn)D組和LIP+FD組的Bcl-2和Bax蛋白表達增加，Bcl-2/Bax的比值降低，而LIP組的Bcl-2、Bax蛋白表達及Bcl-2/Bax的比值無明顯改變(P>0.05)；與FD組比較，LIP+FD組Bcl-2/Bax蛋白表達的比值增加,見圖5。

Figure 3. The protein expression of Bcl-2 in hippocampal neurons of fetal rats detected by immunohistochemical method (DAB staining，×400).

Figure 4. The protein expression of Bax in hippocampal neurons of fetal rats detected by immunohistochemical method (DAB staining, ×400).

Figure 5. The protein expression of Bcl-2 and Bax in hippocampal neurons of fetal rats determined by Western blotting. β-actin was used as loading control. Mean±SD.n=6. *P<0.05 vs S; #P<0.05 vs FD.

討 論

本研究通過阻斷孕鼠雙側子宮和卵巢的動靜脈成功復制了胎鼠宮內窘迫模型，胎鼠海馬CA1區(qū)出現(xiàn)了明顯的凋亡現(xiàn)象；同時在宮內窘迫模型的基礎上在母體實施LIP，胎鼠海馬神經元的凋亡減輕，Bcl-2蛋白的表達上調。文獻報道，全身性的低氧預處理可緩解缺血再灌注后新生鼠腦皮質和海馬組織的丟失，改善腦的微循環(huán)[3]。相對于全身性的缺氧預處理，在本實驗中，我們采用母體的LIP，但仍然觀察到了LIP的腦保護作用，且與抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達上調相關。

LIP通過四肢等更能耐受缺血的臟器進行缺氧預處理可以減輕遠隔臟器如腦、心臟、肝等的再灌注損傷，其對臟器保護作用的可行性和有效性，在臨床試驗中不斷得到肯定[1]。Btker等[4]將LIP應用于臨床心梗病人經皮冠脈支架植入術的研究，發(fā)現(xiàn)心肌存活率增加。胎兒宮內窘迫/剖宮娩出可類比心肌梗塞后/支架植入再通，同樣存在缺血/再灌注損傷的病理過程。LIP能激發(fā)機體產生內源性保護機制，其中循環(huán)和/或神經系統(tǒng)是器官間信號傳導通路。在體的胎鼠與母體通過胎盤屏障和血液系統(tǒng)存在物質交換。孕后期胎盤屏障通透性增加，研究報道分子量為169的谷氨酸鈉不但可通過孕鼠的胎盤屏障還能透過胎鼠的血腦屏障，而一氧化氮(nitric oxide,NO)分子量僅30，還具有高脂溶性，可快速透過生物膜擴散。在LIP遠隔臟器保護效應的研究中，較多文獻肯定了NO在快速保護相中的第一信使角色，據(jù)此推測在孕鼠LIP對胎鼠海馬神經元的保護機制中可能扮演重要角色。低濃度的NO能通過促進抗凋亡蛋白Bcl-2和熱休克蛋白70的表達以及抑制胱天蛋白酶家族的作用來抑制細胞的凋亡[5]。而外源性Bcl-2反義寡脫氧核苷酸下調Bcl-2蛋白表達的同時，阻斷了腦缺血預處理的腦保護作用[6]。因此本實驗中，母體的LIP可能通過產生低濃度的NO透過胎盤屏障促進了胎鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2蛋白表達，從而減輕了宮內窘迫胎鼠復氧后海馬神經元的凋亡。

綜上所述，本研究在胎鼠急性缺氧期間，在母體實施LIP預處理，信號分子能通過胎盤屏障激發(fā)胎兒中樞神經系統(tǒng)的內源性保護機制，減輕了胎鼠復氧后海馬神經元的凋亡，其中機制可能與上調了胎鼠海馬CA1區(qū)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達相關，進一步的研究中將對新生鼠的學習記憶能力等行為學深入探討。

[參 考 文 獻]

[1] 王良榮，鄭瀏璞，蔣柳明，等. 無創(chuàng)性缺血預處理對肢體缺血再灌注性肺換氣功能損傷及一氧化氮/內皮素-1失衡的影響[J].中國病理生理雜志，2010, 26(2):322-326.

[2] 陳光獻，唐白云，梁孟亞，等. 遠程預處理通過下調鈣網(wǎng)蛋白高表達減輕在體大鼠心肌細胞缺血再灌注損傷[J]. 中國病理生理雜志，2009, 25(8):1469-1473.

[3] Lin WY, Chang YC, Ho CJ, et al. Ischemic preconditioning reduces neurovascular damage after hypoxia-ischemia via the cellular inhibitor of apoptosis 1 in neonatal brain[J]. Stroke, 2013, 44(1):162-169.

[5] Chung HT, Pae HO, Choi BM, et al. Nitric oxide as a bioregulator of apoptosis[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 282(5):1075-1079.

[6] Shimizu S, Nagayama T, Jin KL, et al.bcl-2 antisense treatment prevents induction of tolerance to focal ischemia in the rat brain[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2001, 21(3):233-243.