產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌株的篩選鑒定及酶學(xué)性質(zhì)

陳希+王淑芬+王天賜+吳華偉

摘要：利用環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（ＣＧＴａｓｅ）快速篩選法從枝江酒業(yè)的酵泥中篩選獲得１１株ＣＧＴａｓｅ產(chǎn)生菌。用酚酞法測(cè)定所得１１株菌株的酶活，最終得到β－ＣＧＴａｓｅ酶活最高的一株菌株，命名為Ｈｈｊ－１。通過(guò)對(duì)菌株的形態(tài)觀察以及１６Ｓ ｒＤＮＡ測(cè)定，并建立該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定該菌株屬于坎皮納斯類芽孢桿菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｍｐｉｎａｓｅｎｓｉｓ）。對(duì)該菌所產(chǎn)的β－ＣＧＴａｓｅ粗酶液酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，結(jié)果表明，該酶的最適反應(yīng)溫度為７０ ℃，最適反應(yīng)ｐＨ為７．５。在３５～４５ ℃保溫１ ｈ相對(duì)酶活仍可保持在９０％以上，且該酶在ｐＨ ５．０～１０．０的較寬范圍內(nèi)都較穩(wěn)定，說(shuō)明其對(duì)ｐＨ適應(yīng)范圍較廣，因此應(yīng)用有較大的靈活性。

關(guān)鍵詞：β－環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶；鑒定；坎皮納斯類芽孢桿菌（Paenibacillus campinasensis）；酶學(xué)性質(zhì)

中圖分類號(hào)：ＴＳ２０１．２５文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：０４３９－８１１４（２０１４）０８－1891－０4

Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ Ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ－ｐｒｏｄｕｃｔｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｔｒａｉｎ

ＣＨＥＮ Ｘｉ，ＷＡＮＧ Ｓｈｕ－ｆｅｎ，ＷＡＮＧ Ｔｉａｎ－ｃｉ，ＷＵ Ｈｕａ－ｗｅｉ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｙａｎｇｔｚｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｊｉｎｇｚｈｏｕ ４３４０２５，Ｈｕｂｅｉ， Cｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Using rapid screening methoｄ， １１ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｎｇ ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＧＴａｓｅ） ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｍｕｄ ｏｆ ＺｈｉＪｉａｎｇ ｌｉｑｕｏｒ， Ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅｓｅ １１ ｓｔｒａｉｎｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｓｌｉｇｈｔｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｈｅｎｏｌｐｈｔｈａｌｅｉｎ ｍｅｔｈｏｄ． Ａ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｎｄ ｎａｍｅｄ Ｈｈｊ－１． Ｔｈｉｓ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｍｐｉｎａｓｅｎｓｉｓ ｂｙ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｅｎｃｅｓ． Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ β－ＣＧＴａｓｅ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ β－ＣＧＴａｓｅ ｗａｓ ７０ ℃ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐＨ ｗａｓ ７．５． Ｔｈｉｓ ｅｎｚｙｍｅ ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ ９０％ ｏｆ ｉｔｓ ｉｎｉｔｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｆｔｅｒ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ １ ｈｏｕｒ ａｔ ３５～４５ ℃． Ｉｔ ｗａｓ ｓｔａｂｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐＨ ５．０－１０．０， ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｉｔ ｗａｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ａ ｗｉｄｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｐＨ ｖａｌｕｅ ｗｉｔｈ ｇｒｅａｔ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ； ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ； Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｍｐｉｎａｓｅｎｓｉs； ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ

環(huán)糊精（cyclodextrin，簡(jiǎn)稱CD）是由D-吡喃葡萄糖基以α-1，4-葡萄糖苷鍵連接成的環(huán)狀低聚糖。根據(jù)組成葡萄糖基個(gè)數(shù)的不同，將環(huán)糊精分為α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精（葡萄糖基個(gè)數(shù)分別為6、7、8個(gè)）。3種環(huán)糊精中β-環(huán)糊精的溶解度最小，容易結(jié)晶析出，因此它便于生產(chǎn)。環(huán)糊精可將許多疏水性化學(xué)物質(zhì)包結(jié)在其獨(dú)特的環(huán)形疏水空隙內(nèi)，改善其理化性質(zhì)，在制藥、食品、農(nóng)業(yè)及化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛［1，2］。

環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（Cyclodextrin glycosyltransferase，CGTase， EC 2. 4. 1.19）是糖基水解酶α-淀粉酶家族的重要成員，催化淀粉合成環(huán)糊精，它通過(guò)環(huán)化作用、耦合作用、歧化作用、水解作用來(lái)催化環(huán)糊精的生成反應(yīng)。環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)均采用酶法合成， 在環(huán)糊精研究的早期，由于沒(méi)有篩選出高效生產(chǎn)CGTase的菌株而導(dǎo)致環(huán)糊精的生產(chǎn)效率很低， 環(huán)糊精的應(yīng)用受到很大限制?？梢援a(chǎn)CGTase的微生物主要是芽孢桿菌屬（Bacillus）微生物，包括嗜熱脂肪芽孢桿菌（B. stearothermophilis）、耐堿性巨大芽孢桿菌（B. megateruim）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、環(huán)化芽孢桿菌（B. circulans）等［3］。為實(shí)現(xiàn)β-CD的低成本工業(yè)化生產(chǎn)，篩選出具有產(chǎn)較高活性β-CGTase的菌株是關(guān)鍵，并為后續(xù)發(fā)掘優(yōu)秀的基因資源，利用基因工程大量生產(chǎn)CGTase奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1土壤樣本新鮮土樣取自湖北省枝江酒業(yè)發(fā)酵窖泥中。

1.1.2培養(yǎng)基平板篩選培養(yǎng)基：1 000 mL培養(yǎng)基中，可溶性淀粉10 g，蛋白胨5 g，酵母膏5 g，K2HPO4 1 g， MgSO4 0.098 g，Na2CO3 5 g，酚酞0.3 g，甲基橙0.1 g，瓊脂15 g；發(fā)酵培養(yǎng)基：1 000 mL培養(yǎng)基中，可溶性淀粉10 g，蛋白胨5 g，酵母膏5 g，K2HPO4 1 g，MgSO4 0.098 g，Na2CO3 5 g。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1β-CGTase產(chǎn)生菌的篩選①初篩。取5 g土樣放入裝有45 mL去離子水及玻璃珠的250 mL三角瓶中，80 ℃水浴處理5 min，靜置30 min，取上清液稀釋后涂布于篩選平板培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2~3 d。挑取四周出現(xiàn)較大黃色透明圈的菌落進(jìn)一步劃線純化。②復(fù)篩。 挑取平板上的單菌落，放在裝有5 mL液體培養(yǎng)基的試管中，37 ℃，180 r/min擴(kuò)大培養(yǎng)一夜，再取10%的菌落放在裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，230 r/min培養(yǎng)48 h。將發(fā)酵液于4 000 r/min離心20 min，得到粗酶液，進(jìn)行酶活測(cè)定，挑取酶活性較高的菌株進(jìn)行保藏。以酶活最高的菌株作進(jìn)一步研究的出發(fā)菌株。

1.2.2β-CGTase產(chǎn)生菌的鑒定①形態(tài)鑒定。取保藏的菌株在篩選培養(yǎng)基上劃線，37 ℃培養(yǎng)2~3 d，觀察菌落形狀、大小、表面光滑度、菌落及培養(yǎng)基顏色，并且取菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏染色。②分子鑒定。提取菌株基因組總DNA［4，5］，用細(xì)菌通用引物: 上游引物27F（5-AGGTTTGATCCTGGCTCAG-3） 和下游引物1492R（5-GGYTACCTTGTTACGACT-3（Y表示C或T堿基）），擴(kuò)增菌株的16S rDNA 片段。將擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并用DNA凝膠回收試劑盒純化。純化后的DNA與pMD18-T載體連接，經(jīng)電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒交公司測(cè)序。將所得到的16S rDNA全序列在NCBI中進(jìn)行Blast比對(duì)，選取同源性較高的典型菌株的16S rDNA序列作為參比對(duì)象，然后采用鄰接法，用MEGA 5.1構(gòu)建供試菌與參比菌之間的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，確定菌株種屬［6-8］。

1.2.3β-CGTase酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

1）β-CGTase酶活測(cè)定采用酚酞法測(cè)定酶活性［9-13］。

2）酶作用的最適溫度在反應(yīng)溫度分別為35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 ℃的條件下，pH 7.0，反應(yīng)10 min測(cè)定酶活。最高酶活為100%，其余折算成相對(duì)酶活。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，確定酶的最適反應(yīng)溫度。

3）溫度對(duì)酶活穩(wěn)定性的影響將酶液分別在35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 ℃保溫1 h，以未經(jīng)處理的酶活為100%，計(jì)算各溫度下保持1 h的相對(duì)酶活。

4）酶作用的最適pH分別在pH為4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的緩沖液（50 mmol/L鄰苯二甲酸氫鉀-咪唑）中測(cè)定酶活。最高酶活為100%，其余折算成相對(duì)酶活，確定酶的最適反應(yīng)pH。

5） pH對(duì)酶活穩(wěn)定性的影響將酶液分別在pH 4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的緩沖液（50 mmol/L鄰苯二甲酸氫鉀-咪唑）中室溫下放置1 h，然后測(cè)定酶活。以未經(jīng)處理的酶活為100%，計(jì)算不同pH下保持1 h的相對(duì)酶活。

2結(jié)果與分析

2.1β-CGTase產(chǎn)生菌的篩選

2.1.1初篩在所采土樣中分離出能使紅色篩選平板產(chǎn)生較大黃色透明圈的菌株，根據(jù)透明圈大小，得到11株CGTase產(chǎn)生菌。

2.1.2復(fù)篩將分離所得的11株菌進(jìn)行篩選發(fā)酵試驗(yàn)，經(jīng)酶活測(cè)定，選出酶活較高的6株菌株，按酶活由高到低分別編號(hào)為Hhj-1~Hhj-6（表1）。由于Hhj-1的酶活力最高，故選用Hhj-1做進(jìn)一步地探討，菌株Hhj-1、Hhj-2、Hhj-3在篩選平板上產(chǎn)生的透明圈如圖1所示。

2.2菌株的鑒定

2.2.1形態(tài)鑒定在篩選培養(yǎng)基上，菌落周圍產(chǎn)生黃色透明圈，菌落呈微黃色，扁平呈圓形不透明，表面較干燥，邊沿不整齊，正反面顏色一致。菌株在光學(xué)顯微鏡下為桿狀，芽孢卵圓形、端生，革蘭氏染色為陽(yáng)性菌。

2.2.2分子鑒定提取菌株Hhj-1基因組DNA， 通過(guò)PCR得到菌株Hhj-1的16S rDNA（圖2）。由北京澳科鼎盛公司測(cè)得Hhj-1的16S rDNA 序列長(zhǎng)度為1 511 bp，經(jīng)過(guò)基因庫(kù)搜索比對(duì)，與Paenibacillus campinasensis strain BL11、Paenibacillus sp.、Paenibacillus campinasensis等菌有99%的同源性。將16S rDNA序列提交到GeneBank中得到登錄號(hào)KF14343。在搜索比對(duì)結(jié)果中選擇與菌株Hhj-1同源性較高的16個(gè)菌株，采用鄰接法用MEGA 5.1建立Hhj-1的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3）。結(jié)合菌株Hhj-1的生理生化和16S rDNA序列相似性，對(duì)照《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，鑒定菌株Hhj-1屬于坎皮納斯類芽孢桿菌（Paenibacillus campinasensis）。

2.3β-CGTase酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1酶作用的最適溫度以淀粉為底物，在35~90 ℃溫度范圍內(nèi)研究了β-CGTase活性。溫度-活性曲線（圖4）表明該酶的最適溫度為70 ℃，此時(shí)酶活為3.15 U/mL，在35~65 ℃溫度范圍內(nèi)，酶活隨溫度提高而迅速上升，但是當(dāng)溫度高于75 ℃，酶活急劇下降，說(shuō)明酶已較快地失活。

2.3.2溫度對(duì)酶活穩(wěn)定性的影響將該酶在不同溫度下保溫1 h后，在pH為7.0， 65 ℃條件下測(cè)定酶活，結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出，在35~55 ℃下保溫1 h相對(duì)酶活仍可保持在80%以上，65 ℃保溫1 h后酶活急劇下降，70~90 ℃保溫1 h相對(duì)酶活很低，幾乎失活。由此推斷，該酶適宜在中溫情況下進(jìn)行催化反應(yīng)。

2.3.3酶作用的最適pH以淀粉為底物，在65 ℃條件下測(cè)定β-CGTase的酶活。pH 4~10范圍內(nèi)的變化情況如圖6所示。圖6結(jié)果表明，該酶所適應(yīng)的pH范圍很廣，其中最適pH為7.5，此時(shí)酶活最高。同時(shí)pH為 5.5時(shí)也有一個(gè)小高峰。

2.3.4pH對(duì)酶活穩(wěn)定性的影響將該酶在不同pH的緩沖液中室溫下放置1 h后，在65 ℃條件下測(cè)定β-CGTase的相對(duì)酶活，試驗(yàn)結(jié)果（圖7）表明，該酶在pH 5.0～10.0的范圍內(nèi)都很穩(wěn)定，說(shuō)明其對(duì)pH適應(yīng)范圍廣，尤其在堿性范圍內(nèi)相當(dāng)穩(wěn)定，因此在保存或進(jìn)行催化反應(yīng)時(shí)對(duì)pH的要求較靈活。

3結(jié)論

β-CGTase的作用底物為淀粉，故選擇淀粉含量高的枝江酒業(yè)的酵泥為土樣。篩選得到11株產(chǎn)CGTase的菌株，再經(jīng)酚酞法測(cè)定酶活，得到β-CGTase酶活最高的菌株編號(hào)為Hhj-1，作為出發(fā)菌株進(jìn)一步研究。對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)觀察，菌落表面干燥，圓形但邊沿不整齊。菌株為桿狀，芽孢卵圓形且端生，經(jīng)革蘭氏染色鑒定為革蘭氏陽(yáng)性菌。經(jīng)16S rDNA鑒定，該菌株為坎皮納斯類芽孢桿菌，并將16S rDNA序列提交到GeneBank中得到登錄號(hào)KF14343。

用酚酞法對(duì)粗酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，該酶的最適反應(yīng)溫度為70 ℃，最適反應(yīng)pH為7.5。在35~45 ℃保溫1 h相對(duì)酶活仍可保持在90%以上，且該酶在pH 5.0～10.0的范圍內(nèi)都較穩(wěn)定，說(shuō)明其對(duì)pH適應(yīng)范圍較廣，因此應(yīng)用時(shí)有較大的靈活性。

參考文獻(xiàn)：

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［2］ 陳龍然，袁康培，馮明光，等. 一株產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的地衣芽孢桿菌的選育、產(chǎn)酶條件及酶學(xué)特性［J］. 微生物學(xué)報(bào)，2005，45（1）:97-101.

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［13］ 劉燕華. 分光光度法測(cè)定β-環(huán)狀糊精［J］. 日用化學(xué)工業(yè)，1990（6）：35-36.

1.2.3β-CGTase酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

1）β-CGTase酶活測(cè)定采用酚酞法測(cè)定酶活性［9-13］。

2）酶作用的最適溫度在反應(yīng)溫度分別為35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 ℃的條件下，pH 7.0，反應(yīng)10 min測(cè)定酶活。最高酶活為100%，其余折算成相對(duì)酶活。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，確定酶的最適反應(yīng)溫度。

3）溫度對(duì)酶活穩(wěn)定性的影響將酶液分別在35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 ℃保溫1 h，以未經(jīng)處理的酶活為100%，計(jì)算各溫度下保持1 h的相對(duì)酶活。

4）酶作用的最適pH分別在pH為4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的緩沖液（50 mmol/L鄰苯二甲酸氫鉀-咪唑）中測(cè)定酶活。最高酶活為100%，其余折算成相對(duì)酶活，確定酶的最適反應(yīng)pH。

5） pH對(duì)酶活穩(wěn)定性的影響將酶液分別在pH 4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的緩沖液（50 mmol/L鄰苯二甲酸氫鉀-咪唑）中室溫下放置1 h，然后測(cè)定酶活。以未經(jīng)處理的酶活為100%，計(jì)算不同pH下保持1 h的相對(duì)酶活。

2結(jié)果與分析

2.1β-CGTase產(chǎn)生菌的篩選

2.1.1初篩在所采土樣中分離出能使紅色篩選平板產(chǎn)生較大黃色透明圈的菌株，根據(jù)透明圈大小，得到11株CGTase產(chǎn)生菌。

2.1.2復(fù)篩將分離所得的11株菌進(jìn)行篩選發(fā)酵試驗(yàn)，經(jīng)酶活測(cè)定，選出酶活較高的6株菌株，按酶活由高到低分別編號(hào)為Hhj-1~Hhj-6（表1）。由于Hhj-1的酶活力最高，故選用Hhj-1做進(jìn)一步地探討，菌株Hhj-1、Hhj-2、Hhj-3在篩選平板上產(chǎn)生的透明圈如圖1所示。

2.2菌株的鑒定

2.2.1形態(tài)鑒定在篩選培養(yǎng)基上，菌落周圍產(chǎn)生黃色透明圈，菌落呈微黃色，扁平呈圓形不透明，表面較干燥，邊沿不整齊，正反面顏色一致。菌株在光學(xué)顯微鏡下為桿狀，芽孢卵圓形、端生，革蘭氏染色為陽(yáng)性菌。

2.2.2分子鑒定提取菌株Hhj-1基因組DNA， 通過(guò)PCR得到菌株Hhj-1的16S rDNA（圖2）。由北京澳科鼎盛公司測(cè)得Hhj-1的16S rDNA 序列長(zhǎng)度為1 511 bp，經(jīng)過(guò)基因庫(kù)搜索比對(duì)，與Paenibacillus campinasensis strain BL11、Paenibacillus sp.、Paenibacillus campinasensis等菌有99%的同源性。將16S rDNA序列提交到GeneBank中得到登錄號(hào)KF14343。在搜索比對(duì)結(jié)果中選擇與菌株Hhj-1同源性較高的16個(gè)菌株，采用鄰接法用MEGA 5.1建立Hhj-1的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3）。結(jié)合菌株Hhj-1的生理生化和16S rDNA序列相似性，對(duì)照《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，鑒定菌株Hhj-1屬于坎皮納斯類芽孢桿菌（Paenibacillus campinasensis）。

2.3β-CGTase酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1酶作用的最適溫度以淀粉為底物，在35~90 ℃溫度范圍內(nèi)研究了β-CGTase活性。溫度-活性曲線（圖4）表明該酶的最適溫度為70 ℃，此時(shí)酶活為3.15 U/mL，在35~65 ℃溫度范圍內(nèi)，酶活隨溫度提高而迅速上升，但是當(dāng)溫度高于75 ℃，酶活急劇下降，說(shuō)明酶已較快地失活。

2.3.2溫度對(duì)酶活穩(wěn)定性的影響將該酶在不同溫度下保溫1 h后，在pH為7.0， 65 ℃條件下測(cè)定酶活，結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出，在35~55 ℃下保溫1 h相對(duì)酶活仍可保持在80%以上，65 ℃保溫1 h后酶活急劇下降，70~90 ℃保溫1 h相對(duì)酶活很低，幾乎失活。由此推斷，該酶適宜在中溫情況下進(jìn)行催化反應(yīng)。

2.3.3酶作用的最適pH以淀粉為底物，在65 ℃條件下測(cè)定β-CGTase的酶活。pH 4~10范圍內(nèi)的變化情況如圖6所示。圖6結(jié)果表明，該酶所適應(yīng)的pH范圍很廣，其中最適pH為7.5，此時(shí)酶活最高。同時(shí)pH為 5.5時(shí)也有一個(gè)小高峰。

2.3.4pH對(duì)酶活穩(wěn)定性的影響將該酶在不同pH的緩沖液中室溫下放置1 h后，在65 ℃條件下測(cè)定β-CGTase的相對(duì)酶活，試驗(yàn)結(jié)果（圖7）表明，該酶在pH 5.0～10.0的范圍內(nèi)都很穩(wěn)定，說(shuō)明其對(duì)pH適應(yīng)范圍廣，尤其在堿性范圍內(nèi)相當(dāng)穩(wěn)定，因此在保存或進(jìn)行催化反應(yīng)時(shí)對(duì)pH的要求較靈活。

3結(jié)論

β-CGTase的作用底物為淀粉，故選擇淀粉含量高的枝江酒業(yè)的酵泥為土樣。篩選得到11株產(chǎn)CGTase的菌株，再經(jīng)酚酞法測(cè)定酶活，得到β-CGTase酶活最高的菌株編號(hào)為Hhj-1，作為出發(fā)菌株進(jìn)一步研究。對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)觀察，菌落表面干燥，圓形但邊沿不整齊。菌株為桿狀，芽孢卵圓形且端生，經(jīng)革蘭氏染色鑒定為革蘭氏陽(yáng)性菌。經(jīng)16S rDNA鑒定，該菌株為坎皮納斯類芽孢桿菌，并將16S rDNA序列提交到GeneBank中得到登錄號(hào)KF14343。

用酚酞法對(duì)粗酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，該酶的最適反應(yīng)溫度為70 ℃，最適反應(yīng)pH為7.5。在35~45 ℃保溫1 h相對(duì)酶活仍可保持在90%以上，且該酶在pH 5.0～10.0的范圍內(nèi)都較穩(wěn)定，說(shuō)明其對(duì)pH適應(yīng)范圍較廣，因此應(yīng)用時(shí)有較大的靈活性。

參考文獻(xiàn)：

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［2］ 陳龍然，袁康培，馮明光，等. 一株產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的地衣芽孢桿菌的選育、產(chǎn)酶條件及酶學(xué)特性［J］. 微生物學(xué)報(bào)，2005，45（1）:97-101.

［3］ 曹新志，金征宇.環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶高產(chǎn)菌株的快速篩選［J］. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2003，18（6）:53-55.

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［5］ 孫娟娟. 普魯蘭酶在解淀粉芽孢桿菌中表達(dá)方法的探索［D］.江蘇無(wú)錫：江南大學(xué)，2011.

［6］ 郭鳳蓮，陳存社.產(chǎn)淀粉酶枯草芽孢桿菌的16S rRNA測(cè)序鑒定［J］. 中國(guó)釀造，2007（8）:26-28.

［7］ 周發(fā)俊. 甘蔗內(nèi)生固氮菌的分離鑒定及16S rRNA基因克隆和序列分析［D］.福州：福建師范大學(xué)，2009.

［8］ 董安國(guó)，高琳，趙建邦，等. 基于DNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建［J］. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，36（10）：221-226.

［9］ KUO C C， LIN C A ， CHEN J Y，et al. Production of cyclodextrin glucanotransferase from an alkalophilic Bacillus sp. by pH-stat fed-batch fermentation［J］. Biotechnol Lett，2009，31（11）:1723-1727.

［10］ BERHANE T. Optimum extracellular production of recombinant cyclodextrin glucanotransferase from Anawrbranca gottschalkii and its cyclodextrin products［D］.江蘇無(wú)錫：江南大學(xué)，2012.

［11］ LETSIDIDI R. Production and purification of a thermostable cyclodestrin glycosyltransferase with a high starch hydrolytic activity from Bacillus licheniformis SK13.002 and its applicaton for β-cyclodextrin production［D］. 江蘇無(wú)錫：江南大學(xué)，2010.

［12］李明時(shí)，張帆. β-環(huán)糊精的分光光度測(cè)定［J］. 分析化學(xué)，1998，26（7）：912.

［13］ 劉燕華. 分光光度法測(cè)定β-環(huán)狀糊精［J］. 日用化學(xué)工業(yè)，1990（6）：35-36.

1.2.3β-CGTase酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

1）β-CGTase酶活測(cè)定采用酚酞法測(cè)定酶活性［9-13］。

2）酶作用的最適溫度在反應(yīng)溫度分別為35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 ℃的條件下，pH 7.0，反應(yīng)10 min測(cè)定酶活。最高酶活為100%，其余折算成相對(duì)酶活。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，確定酶的最適反應(yīng)溫度。

3）溫度對(duì)酶活穩(wěn)定性的影響將酶液分別在35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 ℃保溫1 h，以未經(jīng)處理的酶活為100%，計(jì)算各溫度下保持1 h的相對(duì)酶活。

4）酶作用的最適pH分別在pH為4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的緩沖液（50 mmol/L鄰苯二甲酸氫鉀-咪唑）中測(cè)定酶活。最高酶活為100%，其余折算成相對(duì)酶活，確定酶的最適反應(yīng)pH。

5） pH對(duì)酶活穩(wěn)定性的影響將酶液分別在pH 4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的緩沖液（50 mmol/L鄰苯二甲酸氫鉀-咪唑）中室溫下放置1 h，然后測(cè)定酶活。以未經(jīng)處理的酶活為100%，計(jì)算不同pH下保持1 h的相對(duì)酶活。

2結(jié)果與分析

2.1β-CGTase產(chǎn)生菌的篩選

2.1.1初篩在所采土樣中分離出能使紅色篩選平板產(chǎn)生較大黃色透明圈的菌株，根據(jù)透明圈大小，得到11株CGTase產(chǎn)生菌。

2.1.2復(fù)篩將分離所得的11株菌進(jìn)行篩選發(fā)酵試驗(yàn)，經(jīng)酶活測(cè)定，選出酶活較高的6株菌株，按酶活由高到低分別編號(hào)為Hhj-1~Hhj-6（表1）。由于Hhj-1的酶活力最高，故選用Hhj-1做進(jìn)一步地探討，菌株Hhj-1、Hhj-2、Hhj-3在篩選平板上產(chǎn)生的透明圈如圖1所示。

2.2菌株的鑒定

2.2.1形態(tài)鑒定在篩選培養(yǎng)基上，菌落周圍產(chǎn)生黃色透明圈，菌落呈微黃色，扁平呈圓形不透明，表面較干燥，邊沿不整齊，正反面顏色一致。菌株在光學(xué)顯微鏡下為桿狀，芽孢卵圓形、端生，革蘭氏染色為陽(yáng)性菌。

2.2.2分子鑒定提取菌株Hhj-1基因組DNA， 通過(guò)PCR得到菌株Hhj-1的16S rDNA（圖2）。由北京澳科鼎盛公司測(cè)得Hhj-1的16S rDNA 序列長(zhǎng)度為1 511 bp，經(jīng)過(guò)基因庫(kù)搜索比對(duì)，與Paenibacillus campinasensis strain BL11、Paenibacillus sp.、Paenibacillus campinasensis等菌有99%的同源性。將16S rDNA序列提交到GeneBank中得到登錄號(hào)KF14343。在搜索比對(duì)結(jié)果中選擇與菌株Hhj-1同源性較高的16個(gè)菌株，采用鄰接法用MEGA 5.1建立Hhj-1的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3）。結(jié)合菌株Hhj-1的生理生化和16S rDNA序列相似性，對(duì)照《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，鑒定菌株Hhj-1屬于坎皮納斯類芽孢桿菌（Paenibacillus campinasensis）。

2.3β-CGTase酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1酶作用的最適溫度以淀粉為底物，在35~90 ℃溫度范圍內(nèi)研究了β-CGTase活性。溫度-活性曲線（圖4）表明該酶的最適溫度為70 ℃，此時(shí)酶活為3.15 U/mL，在35~65 ℃溫度范圍內(nèi)，酶活隨溫度提高而迅速上升，但是當(dāng)溫度高于75 ℃，酶活急劇下降，說(shuō)明酶已較快地失活。

2.3.2溫度對(duì)酶活穩(wěn)定性的影響將該酶在不同溫度下保溫1 h后，在pH為7.0， 65 ℃條件下測(cè)定酶活，結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出，在35~55 ℃下保溫1 h相對(duì)酶活仍可保持在80%以上，65 ℃保溫1 h后酶活急劇下降，70~90 ℃保溫1 h相對(duì)酶活很低，幾乎失活。由此推斷，該酶適宜在中溫情況下進(jìn)行催化反應(yīng)。

2.3.3酶作用的最適pH以淀粉為底物，在65 ℃條件下測(cè)定β-CGTase的酶活。pH 4~10范圍內(nèi)的變化情況如圖6所示。圖6結(jié)果表明，該酶所適應(yīng)的pH范圍很廣，其中最適pH為7.5，此時(shí)酶活最高。同時(shí)pH為 5.5時(shí)也有一個(gè)小高峰。

2.3.4pH對(duì)酶活穩(wěn)定性的影響將該酶在不同pH的緩沖液中室溫下放置1 h后，在65 ℃條件下測(cè)定β-CGTase的相對(duì)酶活，試驗(yàn)結(jié)果（圖7）表明，該酶在pH 5.0～10.0的范圍內(nèi)都很穩(wěn)定，說(shuō)明其對(duì)pH適應(yīng)范圍廣，尤其在堿性范圍內(nèi)相當(dāng)穩(wěn)定，因此在保存或進(jìn)行催化反應(yīng)時(shí)對(duì)pH的要求較靈活。

3結(jié)論

β-CGTase的作用底物為淀粉，故選擇淀粉含量高的枝江酒業(yè)的酵泥為土樣。篩選得到11株產(chǎn)CGTase的菌株，再經(jīng)酚酞法測(cè)定酶活，得到β-CGTase酶活最高的菌株編號(hào)為Hhj-1，作為出發(fā)菌株進(jìn)一步研究。對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)觀察，菌落表面干燥，圓形但邊沿不整齊。菌株為桿狀，芽孢卵圓形且端生，經(jīng)革蘭氏染色鑒定為革蘭氏陽(yáng)性菌。經(jīng)16S rDNA鑒定，該菌株為坎皮納斯類芽孢桿菌，并將16S rDNA序列提交到GeneBank中得到登錄號(hào)KF14343。

用酚酞法對(duì)粗酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，該酶的最適反應(yīng)溫度為70 ℃，最適反應(yīng)pH為7.5。在35~45 ℃保溫1 h相對(duì)酶活仍可保持在90%以上，且該酶在pH 5.0～10.0的范圍內(nèi)都較穩(wěn)定，說(shuō)明其對(duì)pH適應(yīng)范圍較廣，因此應(yīng)用時(shí)有較大的靈活性。

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［2］ 陳龍然，袁康培，馮明光，等. 一株產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的地衣芽孢桿菌的選育、產(chǎn)酶條件及酶學(xué)特性［J］. 微生物學(xué)報(bào)，2005，45（1）:97-101.

［3］ 曹新志，金征宇.環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶高產(chǎn)菌株的快速篩選［J］. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2003，18（6）:53-55.

［4］ 俞玲. 地衣芽孢桿菌pelB，amyX，yvdF基因的功能鑒定與表達(dá)［D］.江蘇無(wú)錫：江南大學(xué)，2009.

［5］ 孫娟娟. 普魯蘭酶在解淀粉芽孢桿菌中表達(dá)方法的探索［D］.江蘇無(wú)錫：江南大學(xué)，2011.

［6］ 郭鳳蓮，陳存社.產(chǎn)淀粉酶枯草芽孢桿菌的16S rRNA測(cè)序鑒定［J］. 中國(guó)釀造，2007（8）:26-28.

［7］ 周發(fā)俊. 甘蔗內(nèi)生固氮菌的分離鑒定及16S rRNA基因克隆和序列分析［D］.福州：福建師范大學(xué)，2009.

［8］ 董安國(guó)，高琳，趙建邦，等. 基于DNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建［J］. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，36（10）：221-226.

［9］ KUO C C， LIN C A ， CHEN J Y，et al. Production of cyclodextrin glucanotransferase from an alkalophilic Bacillus sp. by pH-stat fed-batch fermentation［J］. Biotechnol Lett，2009，31（11）:1723-1727.

［10］ BERHANE T. Optimum extracellular production of recombinant cyclodextrin glucanotransferase from Anawrbranca gottschalkii and its cyclodextrin products［D］.江蘇無(wú)錫：江南大學(xué)，2012.

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［13］ 劉燕華. 分光光度法測(cè)定β-環(huán)狀糊精［J］. 日用化學(xué)工業(yè)，1990（6）：35-36.