GC/MS法同時分析液體制劑及口服液型保健品中31種防腐劑和抗氧化劑

陳安東，吳兆偉，余 倩，王鐵松，車寶泉，叢駱駱

(1.北京市藥品檢驗所，北京 100035； 2. 北京市食品藥品監(jiān)督管理局，北京 100053)

防腐劑和抗氧化劑是藥品、保健食品中常見的添加劑，具有防腐、抑菌殺菌、延長保質(zhì)期的作用，常用的防腐劑與抗氧化劑有苯甲醇、山梨酸、乙氧基喹啉、尼鉑金類、異噻唑啉酮類、苯扎氯銨類等[1-7]。目前，關(guān)于防腐劑與抗氧化劑的研究已有文獻報道，但主要集中在食品、化妝品和一些工業(yè)領(lǐng)域中[8-17]。在藥品中同類物質(zhì)的研究報道較少，且被測組份經(jīng)常為單一領(lǐng)域內(nèi)使用的防腐劑及抗氧化劑，一次性檢測的種類一般不超過20種。而目前在醫(yī)藥行業(yè)，一些企業(yè)利用監(jiān)管部門還未制定防腐劑及抗氧化劑使用規(guī)定的現(xiàn)狀，在利益的驅(qū)使下，使用了廉價的或不允許添加的、跨行業(yè)的防腐劑，給人們的用藥安全帶來了危害。針對這種情況，有必要開發(fā)一種可用于檢測藥品、保健品中的防腐劑及抗氧化劑的方法，為藥品監(jiān)管提供有力的技術(shù)支持。

本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)聯(lián)用技術(shù)，建立一次檢測31種防腐劑及抗氧化劑的方法。為配合藥品監(jiān)管，該方法的被測物質(zhì)涵蓋了藥品、食品、保健品和化妝品等多個行業(yè)中常見的防腐劑和抗氧化劑。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TRACE 1310 ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Thermo-Fisher公司產(chǎn)品；Agilent 7890A-5930氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國Agilent公司產(chǎn)品；超聲儀SB-25-12-DT：寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

無水乙醇(色譜級)：德國Merck公司產(chǎn)品；對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯的對照品：由中國食品藥品檢定研究院提供；丙酸、苯甲醇、山梨酸、苯甲酸、桂皮醛、對羥基苯甲酸異丁酯：美國AccuStandard公司產(chǎn)品；三氯叔丁醇、苯酚、鄰甲酚、對甲酚、間甲酚、2-甲基異噻唑啉酮、2-甲基氯異噻唑啉酮、苯氧乙醇、麝香草酚、對氯鄰甲酚、對氯間二甲酚、叔丁基羥基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)：德國Dr. Ehrenstrofer 公司產(chǎn)品；脫氫乙酸、叔丁基對苯二酚(TBHQ)、對羥基苯甲酸正庚酯：北京百靈威科技有限公司產(chǎn)品；對羥基苯甲酸異丙酯、乙氧基喹啉、己基間苯二酚：東京化成工業(yè)株式會社產(chǎn)品；桉葉素：美國 ChromaDex公司產(chǎn)品；苯乙醇：美國Chem Service公司產(chǎn)品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取0.01 g各種防腐劑及抗氧化劑對照品，以無水乙醇為溶劑，稀釋成各組份濃度為0.05 g/L溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)品儲備液A；精確量取1 mL標(biāo)準(zhǔn)品儲備液A，置于100 mL量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，作為標(biāo)準(zhǔn)品儲備液B；標(biāo)準(zhǔn)品儲備液A和B均放置于4 ℃冰箱中，冷藏保存。

分別精確量取2.0、1.0、0.5 mL標(biāo)準(zhǔn)品儲備液A和10.0、5.0、1.0、0.5 mL標(biāo)準(zhǔn)品儲備液B，置于已精確加入0.4 mL空白基質(zhì)樣品(即經(jīng)檢測各組份均低于檢出限的中藥口服液樣品，基質(zhì)為水溶液)的50 mL容量瓶中，加適量無水乙醇，超聲10 min，冷卻后加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，過0.22 μm濾膜，作為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液1～7，其中防腐劑的含量分別為2.0、1.0、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005 mg/L。

1.3 樣品前處理

精確量取2.0 mL搖勻后樣品于250 mL量瓶中，加適量無水乙醇，超聲10 min，冷卻后加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，過0.22 μm濾膜，待上機分析。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

1.4.1色譜條件 色譜柱：DB-624UI(60 m×0.25 mm×1.4 μm)；進樣口溫度：250 ℃；升溫程序：初始溫度60 ℃，保持1 min，以50 ℃/min升至150 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升至250 ℃，保持25 min；初始流速1 mL/min，保持20 min，以2 mL/min升至2 mL/min，保持20 min；載氣：He；進樣量：1 μL；分流進樣，分流比5∶1。

1.4.2質(zhì)譜條件 傳輸線溫度：250 ℃；離子源溫度：280 ℃；離子化方式：EI；電子能量：70 eV；延遲時間：6.0 min；檢測方式：選擇離子監(jiān)測(SIM)。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以及典型樣品的總離子流圖

在1.4條件下，分別采用Thermo TRACE 1310 ISQ氣質(zhì)聯(lián)用儀和Agilent 7890A-5930氣質(zhì)聯(lián)用儀對標(biāo)準(zhǔn)工作溶液1進樣，獲得的SIM離子流圖示于圖1、圖2。經(jīng)比較，31種防腐劑和抗氧化劑在兩臺不同廠家的儀器中保留時間基本一致，分離效果良好。31種防腐劑和抗氧化劑的保留時間及特征離子峰列于表1，滴眼液1樣品的離子流圖示于圖3。

2.2 基質(zhì)干擾

實驗中繪制了2條標(biāo)準(zhǔn)曲線：一條為1.2中標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(即已添加了水溶液基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線)；另一條與第1條曲線中各待測物質(zhì)濃度一致，但未加空白基質(zhì)樣品?，F(xiàn)取其中一點(濃度為0.1 mg/L)對其峰面積進行對比(由于組份太多，僅選其中的9種)，結(jié)果示于圖4。由圖4可見，大部分組份的基質(zhì)效應(yīng)明顯，相同濃度組份的峰面積差別較大，因此在進行定量分析時，應(yīng)采用基質(zhì)加標(biāo)法做標(biāo)準(zhǔn)曲線，所用的基質(zhì)應(yīng)與待測樣品同劑型。

圖1 使用TRACE 1310 ISQ測定31種防腐劑及抗氧化劑的SIM色譜圖Fig.1 Chromatogram of 31 preservatives and antioxidants by TRACE 1310 ISQ

圖2 使用Agilent 7890A-5930測定31種防腐劑及抗氧化劑的SIM色譜圖Fig.2 Chromatogram of 31 preservatives and antioxidants by Agilent 7890A-5930

圖3 使用TRACE 1310 ISQ測定滴眼液1樣品的SIM色譜圖Fig.3 Chromatogram of eye drops 1 sample by TRACE 1310 ISQ

序號名稱保留時間/min 定量離子m/z定性離子m/z1丙酸 Propionic acid6.7674.057.0, 73.02三氯叔丁醇 Acetonchloroform hemihydrate10.7559.077.0, 125.031,4-桉葉素 1,4-Cineole11.0281.0108.0, 154.04苯酚 Phenol11.0494.066.0, 65.05苯甲醇 Benzyl alcohol11.63108.079.0, 107.06山梨酸 Sorbic acid11.88112.097.0, 67.07鄰甲酚 o-Cresol12.02108.0107.0, 79.08間甲酚 p-Cresol12.41108.0107.0, 79.09對甲酚 m-Cresol12.41108.0107.0, 79.010苯乙醇 Phenethyl alcohol12.8791.0122.0, 92.011苯甲酸 Benzoic acid13.77105.0122.0, 77.012甲基異噻唑啉酮 Methylisothiazolinone14.37115.087.0, 58.013苯氧乙醇 2-Phenoxyethanol14.5694.077.0, 138.014甲基氯異噻唑啉酮 Methylisothiazolinone14.82149.057.0, 85.015麝香草酚 Thymol15.35135.0150.0, 91.016桂皮醛 Cinnamaldehyde15.49131.0132.0, 103.017對氯鄰甲酚 4-Chloro-2-methylphenol15.84107.0142.0, 77.018脫氫乙酸 Dehydroacetic acid17.13168.0153.0, 85.019對氯間二甲酚 4-Chloro-3,5-dimethylphenol17.69121.0156.0, 91.0202,6-二叔丁基對甲酚 BHT18.47205.0220.0, 145.021叔丁基羥基茴香醚 BHA18.79165.0137.0, 180.022對羥基苯甲酸甲酯 Methylparaben19.48121.0152.0, 93.023對羥基苯甲酸乙酯 Ethylparaben20.79121.0166.0, 138.024叔丁基對苯二酚 TBHQ21.12151.0166.0, 123.025對羥基苯甲酸異丙酯 Isopropylparaben21.20121.0138.0, 180.026對羥基苯甲酸丙酯 Propylparaben22.50121.0138.0, 180.027乙氧基喹啉 Ethoxyquin23.43202.0174.0, 145.028對羥基苯甲酸異丁酯 Isobutyl 4-hydroxybenzoate23.68121.0138.0, 65.029對羥基苯甲酸丁酯 Butylparaben24.72121.0138.0, 194.030己基間苯二酚 4-Hexyl-1,3-benzenediol27.18123.0194.0, 124.031對羥基苯甲酸庚酯 Heptyl 4-hydroxybenzoate36.52138.0121.0, 65.0

圖4 實驗中的基質(zhì)效應(yīng)Fig.4 Matrix effects on GC/MS analysis

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限、定量限

按1.2方法測定樣品的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為橫坐標(biāo)，得到樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程列于表2。另外，精確量取0.4 mL空白基質(zhì)樣品于50 mL容量瓶中，添加不同體積的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液B，制成比標(biāo)準(zhǔn)工作溶液7濃度更低的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以信噪比S/N=3時的添加濃度作為本方法的檢出限，信噪比S/N=10時的添加濃度作為定量限，31種防腐劑的檢出限為0.001～0.008 mg/L，定量限為0.003～0.020 mg/L，結(jié)果列于表2。

2.4 回收率及精密度

精確量取0.4 mL空白基質(zhì)樣品于50 mL容量瓶中，分別添加0.020、0.060、0.300 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3方法進行樣品前處理和測定，每個水平做3次平行實驗，計算各防腐劑組份的平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs)，結(jié)果列于表3。

另外，精確量取6份0.4 mL空白基質(zhì)樣品，置于50 mL容量瓶中，分別加入一定體積的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中防腐劑含量為0.10 mg/L，按1.3方法進行樣品前處理和測定，計算每個組份的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，作為日內(nèi)精密度，結(jié)果列于表3。

實驗結(jié)果表明，31種物質(zhì)的日內(nèi)精密度均小于5.0%，且大部分小于2.0%，能滿足檢測要求。

2.5 實際樣品檢測

使用本方法對市場上常見的共70批液體藥物制劑及口服液保健品樣品進行檢測，具體品種及檢測結(jié)果列于表4、表5。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)：50%以上的樣品中含有防腐劑，并且其中不少樣品的標(biāo)簽與說明書中均未注明含有防腐劑；在部分藥品中檢出了不允許添加的防腐劑，例如，在6批注射液中檢出微量苯酚。

2.6 實際樣品檢測結(jié)果分析

應(yīng)用本方法在32批非外用藥品中檢出微量苯酚，其中6批為注射液。苯酚是制藥業(yè)中常見的有機原料，使用范圍廣，有很強的中樞神經(jīng)毒性，成人致死量約為1 g[18]。20世紀(jì)，苯酚可用作外用制劑與注射液中的防腐劑，但由于毒性較大，近年來僅限用于外用制劑，不得用于口服液或注射液，而實際檢驗結(jié)果反映出仍有一些廠家違規(guī)使用苯酚。

檢測的70批樣品大部分為水溶液基質(zhì)，定性和定量結(jié)果均良好。除水溶液基質(zhì)外，同時對糖漿劑、酊劑2種不同基質(zhì)進行了檢出限考察，二者的檢出限濃度與水溶液基質(zhì)的結(jié)果基本一致。由于樣品量不足，本實驗僅對2批糖漿、2批酊劑進行了測定，在其中1批酊劑中檢測出山梨酸，說明本方法可以對酊劑及糖漿劑進行定性檢測。

表2 31種防腐劑及抗氧化劑的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

表3 31種防腐劑和抗氧化劑的回收率和日內(nèi)精密度

表4 樣品檢測結(jié)果

表5 檢出防腐劑及抗氧化劑的含量

3 結(jié)論

本實驗建立了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定以水、醇等液體為基質(zhì)的藥品及保健品中的防腐劑及抗氧化劑，方法的線性關(guān)系良好，大部分組份的回收率在90%～110%之間，日內(nèi)精密度均小于5%，方法檢出限能滿足使用要求。應(yīng)用該方法檢測了市場上常見的共70批液體藥物制劑及口服液保健品實際樣品，其中有46批檢出了防腐劑，并且該樣品標(biāo)簽中均未標(biāo)注，說明目前國內(nèi)藥品、保健食品中存在比較嚴重的防腐劑濫用現(xiàn)象，尤其是注射劑中含有防腐劑，存在較大的安全隱患，需要進行嚴格監(jiān)管。

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