尼莫司汀和卡莫司汀導致細胞中DNA股間交聯(lián)的高效液相色譜-電噴霧質譜聯(lián)用研究

李莉莉，陳薛釵，趙麗嬌，鐘儒剛

(北京工業(yè)大學生命科學與生物工程學院，環(huán)境與病毒腫瘤學北京市重點實驗室，北京 100124)

氯乙基亞硝基脲(CENUs)是雙官能團烷化劑類抗癌藥物，臨床上常用的CENUs有卡莫司汀(BCNU)、尼莫司汀(ACNU)、司莫司汀(Me-CCNU)和福莫司汀(FTMS)等，已被廣泛用于治療腦瘤、何杰金氏病、惡性黑色素瘤以及各種實體瘤，其結構式示于圖1。CENUs發(fā)揮抗癌作用與其導致DNA股間交聯(lián)有關[1-3]。在生理條件下，CENUs能夠分解產生氯乙基碳正離子，并與鳥嘌呤O6位發(fā)生親電取代反應生成O6-氯乙基鳥嘌呤(O6-ClEtG)，進一步經(jīng)過重排反應，在鳥嘌呤的N1和胞嘧啶的N3連接形成1-[N-(2’-脫氧胞基)]-2-[N-(2’-脫氧鳥基)]乙烷(dG-dC)股間交聯(lián)產物，阻礙腫瘤細胞DNA的轉錄和復制，最終誘導細胞凋亡[4-5]。然而，CENUs的致癌副作用和耐藥性限制了其進一步開發(fā)和臨床應用。CENUs在發(fā)揮抗癌活性的同時，還能夠作用于正常細胞導致DNA損傷，進而誘發(fā)二次腫瘤[6]，國際癌癥研究所(IARC)已將BCNU列為2A組致癌物質。此外，腫瘤細胞對CENUs的耐藥性也大大降低了該類藥物的化療效果。O6-烷基鳥嘌呤-DNA-烷基轉移酶(AGT)能夠修復CENUs引起的DNA股間交聯(lián)，導致癌細胞對CENUs產生耐藥性[7-9]。Ueda-Kawamitsu等[10]采用熒光分析法測定經(jīng)BCNU處理后L1210細胞中的dG-dC交聯(lián)，發(fā)現(xiàn)反應6 h后交聯(lián)濃度達到最高；然后隨著DNA的修復，交聯(lián)物濃度開始降低。CENUs產生耐藥性的作用機制是，AGT將烷化產物O6-ClEtG上的氯乙基轉移到AGT第145位半胱氨酸殘基上，從而阻斷O6-ClEtG進一步與胞嘧啶反應形成dG-dC交聯(lián)[11-14]。因此，CENUs導致細胞內DNA股間交聯(lián)的研究，對于評價藥物抗癌活性和開發(fā)高效低毒的亞硝基脲類抗癌藥物具有重要意義。

高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質譜(HPLC-ESI-MS/MS)聯(lián)用技術是檢測DNA損傷的有效手段。張俊杰等[15]使用HPLC-ESI-MS/MS法對人結腸癌腫瘤組織中全基因組的DNA甲基化進行研究。Fischhaber等[16]使用HPLC-ESI-MS/MS法對BCNU導致不同序列DNA的股間交聯(lián)進行研究，發(fā)現(xiàn)交聯(lián)作用沒有明顯的DNA序列選擇性。Rahman等[17]對一種新型CENU類烷化劑SJG-136導致的DNA交聯(lián)進行定量分析，結果表明，Pu-GAATG-Py序列產生交聯(lián)的速度最快，而Pu-GATG-Py序列與SJG-136的結合最為穩(wěn)定。Baskerville-Abraham等[18]測定經(jīng)不同濃度順鉑處理后卵巢癌細胞A2780和CP70中交聯(lián)物1,2-guanine-guanine [CP-d(GpG)]的含量，結果表明，對順鉑較為敏感的A2780細胞中，CP-d(GpG)的含量高于具有耐藥性的CP70細胞。Malayappan等[19]對人血樣中環(huán)磷酰胺(CPA)導致的DNA交聯(lián)產物G-NOR-G進行動力學研究，結果表明，在血樣中G-NOR-G交聯(lián)率在8 h達到最大值，之后的16 h內呈下降趨勢。本工作對ACNU和BCNU導致細胞中的DNA股間交聯(lián)進行研究，建立細胞水平上dG-dC交聯(lián)物的檢測方法，比較不同細胞在不同CENUs作用下交聯(lián)率的差異，以期為雙官能團烷化劑類抗癌藥物的抗癌活性評價以及細胞耐藥機制的研究提供實驗依據(jù)。

圖1 氯乙基亞硝基脲類化合物的結構圖Fig.1 Structures of chloroethylnitrosoureas (CENUs)

1 實驗部分

1.1 主要儀器

TSQ Quantum高效液相色譜-電噴霧質譜聯(lián)用儀：美國Thermo-Fisher公司產品，配有電噴霧電離源和Surveyor Plus液相色譜系統(tǒng)；Eppendorf 5355恒溫振蕩反應器：德國Eppendorf公司產品；Z-323K型臺式離心機：德國Hermle公司產品；U-3010紫外可見分光光度計：日本Hitachi公司產品；Microcon YM-30微孔離心過濾器：美國Millipore公司產品。

1.2 主要材料與試劑

小鼠白血病細胞L1210：由北京協(xié)和細胞資源中心提供；小鼠胚胎成纖維細胞NIH/3T3：由中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所提供；dG-dC和15N3-dG-dC標準品：由本實驗室合成[20]；尼莫司汀、卡莫司汀、蛇毒磷酸二酯酶、甲醇、乙腈、異戊醇：美國Sigma公司產品；脫氧核糖核酸酶I (DNase I)、牛腸堿性磷酸酶(CIAP)、核糖核酸酶A (RNase A)、S1核酸酶：TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司產品；蛋白酶K：美國Genview公司產品；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA)(分析純)：北京賽百盛生物技術有限公司產品；十二烷基硫酸鈉(SDS)(分析純)：北京鼎國生物技術有限公司產品；無水乙醇、苯酚、氯仿(分析純)：天津市福晨化學試劑廠產品；水：由美國Pall公司超純水系統(tǒng)制得。

1.3 實驗條件

1.3.1色譜條件 Agilent Zorbax SB C18反相色譜柱(150 mm×2.1 mm×5 μm)，柱溫25 ℃；流動相為去離子水(含0.01%乙酸，溶劑A)和乙腈(溶劑B)；梯度洗脫程序：0 min，95% A，5% B；0～20 min，95%～90% A，5%～10% B；20～23 min，90%～95% A，10%～5% B；23～35 min，95% A，5% B；流速0.2 mL/min；進樣量25 μL。

1.3.2質譜條件 電噴霧離子源(ESI)正離子檢測模式；噴霧電壓4 kV；鞘氣(N2)壓力3.45×105Pa；輔氣(N2)壓力1.03×105Pa；離子傳輸毛細管溫度300 ℃；碰撞能量20 V；源內碰撞誘導解離能8 V；定量分析采用選擇反應掃描(SRM)模式，對m/z521→m/z289和m/z524→m/z292離子通道進行掃描。

1.4 實驗步驟

1.4.1細胞培養(yǎng) 選取2種具有不同AGT活性的細胞進行藥物處理，分別是小鼠胚胎成纖維細胞NIH/3T3 (AGT高表達)和小鼠白血病細胞L1210 (AGT低表達)。NIH/3T3細胞使用DMEM高糖培養(yǎng)基(含4 mmol/LL-谷氨酰胺、4.5 g/L葡萄糖、1.5 g/L碳酸氫鈉)，10%胎牛血清，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。L1210細胞使用DMEM高糖培養(yǎng)基，10%馬血清，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。

1.4.2細胞處理 將細胞樣品設置為空白對照組和加藥處理組?？瞻讓φ战M細胞未做任何藥物處理，只加入等量的藥物溶劑。藥物處理組分別使用ACNU和BCNU進行處理：配制濃度為0.2 mol/L ACNU水溶液和0.2 mol/L BCNU乙醇溶液，將藥物溶液分別加入NIH/3T3和L1210細胞培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基中的藥物濃度為0.3 mmol/L和0.45 mmol/L；將加藥后的NIH/3T3和L1210細胞置于5% CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)6 h。

1.4.3DNA的提取 細胞經(jīng)藥物處理完畢后，立即進行DNA提取。向20 mL反應體系中加入4 mL胰酶(NIH/3T3為貼壁細胞，需將其從培養(yǎng)瓶內壁上吹打下來)，再以磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，3 000 r/min離心10 min以沉淀細胞。棄去培養(yǎng)基，將細胞轉移至50 mL離心管中，加入7 mL細胞裂解緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L EDTA，0.5% SDS，pH 8.0)、40 μL 20 g/L蛋白酶K溶液和150 μL 5 g/L RNaseA溶液，置于37 ℃水浴,恒溫12 h。然后，加入7 mLV(酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)=25∶24∶1的混合溶液，振蕩抽提DNA，以12 000 r/min離心5 min后，將含有DNA的上清液轉移至另一離心管中。向上清液中加入15 mL冷異丙醇，倒轉混勻后，靜置于-20 ℃，可見絲狀DNA析出；以12 000 r/min離心5 min，棄上清液，將DNA沉淀轉移至1.5 mL離心管中。以70%乙醇/水溶液和100%乙醇洗滌沉淀，然后用氮氣吹干，得到細胞DNA。用 10 mmol/L Tris-HCl溶液溶解DNA樣品至1 mL，待酶解反應。

1.4.4DNA樣品的酶解 各取200 μL上述DNA樣品于1.5 mL離心管中，加入15N3-dG-dC內標溶液(濃度為9.6 nmol/L)，將其置于98 ℃水浴中熱變性5 min，然后迅速放入冰浴中冷卻10 min，使DNA雙鏈變成單鏈。加入20 μL脫氧核糖核酸酶I (2.5 U/μL)和30 μL核酶S1(5 U/μL)，37 ℃酸性酶解6 h；然后加入40 μL堿性磷酸酶(0.2 U/μL)和10 μL蛇毒磷酸二酯酶(0.002 U/μL)，37 ℃堿性酶解過夜；將酶解液轉入YM-30離心過濾器，以15 000 r/min離心30 min，除去蛋白，所得濾液轉移至1.5 mL離心管中，待HPLC-MS定量分析。

1.4.5標準溶液的配制 配制濃度分別為0.08、0.2、0.32、0.8、1.6、4、8、16、32、60 nmol/L dG-dC標準溶液，加入15N3-dG-dC內標物。以dG-dC與15N3-dG-dC的濃度比為橫坐標，dG-dC與15N3-dG-dC的峰面積比為縱坐標，繪制標準曲線。

1.4.6方法學驗證 配制濃度分別為2、4、8、16 nmol/L dG-dC溶液，加入15N3-dG-dC內標物。在擬定的分析條件下，一天內進樣測定6次，得到日內準確度和精密度；上述樣品分別在3日內每天連續(xù)測定6次，得到日間準確度和精密度。

取200 μL 6 g/L小牛胸腺DNA溶液，分別加入標準品溶液，使空白DNA溶液中dG-dC的濃度分別為2、4、8、16 nmol/L，每個濃度條件下制備3個平行樣品，并加入15N3-dG-dC內標物，然后進行酶解反應，并在擬定條件下對酶解液中的dG-dC進行定量分析，計算加標回收率。

取200 μL 6 g/L小牛胸腺DNA溶液，分別加入dG-dC標準品溶液，使空白DNA溶液中dG-dC濃度分別為0.2、4、32 nmol/L，每個濃度條件下制備3個平行樣品，并加入15N3-dG-dC內標物，進行酶解反應后，對dG-dC進行定量分析。將上述樣品于室溫放置24 h，然后-20 ℃凍存1個月(其間反復凍融3次)，測定樣品中dG-dC的含量。比較新制備樣品與經(jīng)過放置后樣品中dG-dC的含量，以判斷方法的穩(wěn)定性。將空白對照組細胞離心，按1.4.3方法進行DNA的提取，向得到的DNA中加入15N3-dG-dC內標物，按照1.4.4方法進行DNA酶解，在擬定的檢測條件下進行定量分析，與藥物處理組進行比較以判斷方法的專屬性。

1.4.7交聯(lián)率的計算 根據(jù)公式計算交聯(lián)率，以每109個堿基對中所含dG-dC交聯(lián)的個數(shù)表示。其中，C為測得的dG-dC交聯(lián)濃度(nmol/L)；V為酶解后樣品的體積(V=300 μL)；C0為酶解前樣品DNA的濃度；V0為酶解前樣品的體積(V0=200 μL)；M0為4種脫氧核苷酸的平均分子質量(M0=325 g/mol)，示于式(1)：

dG-dC crosslinks/109base pairs

= (C·V·109·2M0)/(C0·V0)

(1)

2 結果與討論

2.1 方法學驗證結果

dG-dC和15N3-dG-dC標準品的質譜圖示于圖2，分子離子丟失兩側核糖后，形成的碎片離子峰m/z289 (A)和m/z292 (B)均為基峰。采用SRM模式監(jiān)測dG-dC的m/z521→m/z289和15N3-dG-dC的m/z524→m/z292離子通道，所得離子流圖示于圖3，其中，dG-dC和15N3-dG-dC的保留時間分別為15.48 min和15.47 min。線性相關系數(shù)R2為0.999 9，標準曲線示于圖4。結果表明，在dG-dC濃度為0.08～60 nmol/L范圍內，dG-dC和15N3-dG-dC的濃度比與SRM峰面積比的線性關系良好，方法的日內準確度和精密度分別為99.8%～104.1%和2.4%～4.8%，日間準確度和精密度分別為99.1%～103.9%和2.3%～3.7%，列于表1。向小牛胸腺DNA溶液中加入不同濃度dG-dC標準溶液，經(jīng)酶解反應后，測定方法的加標回收率為92.5%～107.4%，列于表2。在擬定的分析條件下，S/N=5測得的dG-dC檢測限(LOD)為2 fmol，S/N=17測得的dG-dC定量限(LOQ)為8 fmol。方法穩(wěn)定性的測定結果列于表3，由表3可見，放置不同時間后，樣品中dG-dC交聯(lián)的濃度基本保持一致，表明dG-dC交聯(lián)在樣品溶液中穩(wěn)定且不受貯存溫度和時間的影響，說明該方法具有良好的穩(wěn)定性?？瞻讓φ战M和藥物處理組細胞DNA中，dG-dC交聯(lián)的SRM掃描離子流圖示于圖5?？瞻讓φ战M中沒有dG-dC交聯(lián)，示于圖5a；經(jīng)藥物處理后的細胞中有明顯的dG-dC交聯(lián)譜峰，示于圖5b。該分析條件下，樣品中未出現(xiàn)干擾dG-dC測定的內源性物質，方法專屬性良好。結果表明，本方法的靈敏度、準確性、穩(wěn)定性和專屬性均能夠滿足細胞中DNA交聯(lián)物的定量分析。

圖2 dG-dC(a)和15N3-dG-dC(b)標準品的二級質譜全掃描譜圖Fig.2 MS2 full scan spectra of dG-dC(a) and 15N3-dG-dC(b)

圖3 dG-dC標準品(a)和15N3-dG-dC內標(b)的SRM離子流圖Fig.3 SRM chromatograms of dG-dC standard(a) and 15N3-dG-dC internal standard(b)圖4 dG-dC定量標準曲線Fig. 4 Calibration curve of dG-dC quantitation

表1 dG-dC交聯(lián)定量分析方法的準確度和精密度

表2 小牛胸腺DNA酶解后樣品中dG-dC交聯(lián)的加標回收率Table 2 Recovery for dG-dC crosslinks in the enzymatic digestion mixtures of calf thymus DNA

表3 小牛胸腺DNA酶解液中dG-dC交聯(lián)物的穩(wěn)定性Table 3 Stabilities for dG-dC crosslinks in the enzymatic digestion mixtures of calf thymus DNA

圖5 空白對照(a)和經(jīng)藥物處理后細胞DNA樣品(b)中dG-dC和15N3-dG-dC的SRM離子流圖Fig.5 SRM chromatograms of dG-dC and 15N3-dG-dC for the control group(a) and the CENUs-treated group(b)

2.2 細胞中dG-dC交聯(lián)物的測定

NIH/3T3和L1210細胞經(jīng)不同濃度ACNU和BCNU處理6 h后，測得的dG-dC交聯(lián)率列于表4。結果表明，使用相同濃度的同種藥物分別處理2種細胞，L1210細胞中的dG-dC交聯(lián)率明顯高于NIH/3T3。AGT可對鳥嘌呤O6位的烷化損傷進行修復，進而阻礙dG-dC交聯(lián)的形成。因此可以推測，癌細胞L1210中的AGT水平較低，使得dG-dC交聯(lián)未能得到有效的修復，從而導致L1210細胞中DNA的交聯(lián)率明顯高于NIH/3T3細胞，這一推測與研究所觀察到的現(xiàn)象符合。Ishiguro等[21]對能導致DNA股間交聯(lián)的新型抗癌藥物克羅拉濱(Cloretazine)進行研究，發(fā)現(xiàn)將編碼AGT的O6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉移酶(MGMT)基因導入L1210細胞后，AGT表達水平提高，藥物的半抑制濃度(IC50)值顯著增加。Tano等[22]發(fā)現(xiàn)經(jīng)CENU處理后的NIH/3T3傳代細胞中，AGT活性顯著增加，細胞對CENU產生了耐藥性。Preuss等[23]分別用ACNU、BCNU、CCNU和HeCNU(Elmustine, 依莫司汀)處理宮頸癌細胞Hela MR (AGT低表達)和HeLa S3 (AGT高表達)，結果表明，4種CENUs對HeLa S3細胞的IC50均高于Hela MR細胞。

表4 經(jīng)ACNU和BCNU處理后NIH/3T3和L1210細胞中的dG-dC交聯(lián)水平Table 4 Levels of dG-dC crosslinks in NIH/3T3 and L1210 cells treated with ACNU and BCNU

兩種細胞經(jīng)ACNU處理后的dG-dC交聯(lián)率均高于BCNU，尤其對于比較敏感的L1210細胞，ACNU的交聯(lián)率顯著高于BCNU。因此，推測ACNU對癌細胞的抑制效果高于BCNU，在臨床上將表現(xiàn)出較好的腫瘤抑制效果。Wolff等[24]對CENUs的臨床應用進行了流行病學研究，對使用ACNU、BCNU、CCNU和FTMS進行治療后的24 193位晚期神經(jīng)膠質瘤患者的壽命進行統(tǒng)計分析，結果表明，ACNU能夠使患者壽命平均延長8.9個月，在4種藥物的臨床應用中表現(xiàn)出最佳的抗癌療效，而BCNU未延長患者壽命。

3 結論

本研究建立了細胞中dG-dC股間交聯(lián)物的HPLC-ESI-MS/MS定量分析方法，該方法具有良好的靈敏度和準確性，并對ACNU和BCNU兩種CENUs藥物導致HIN/3T3和L1210細胞中的dG-dC交聯(lián)進行了測定。結果表明，AGT活性較低的L1210細胞中dG-dC交聯(lián)率較高，而且ACNU的交聯(lián)能力高于BCNU。本工作為雙官能團亞硝基脲類烷化劑抗癌活性的預測和耐藥性的研究提供了可靠的實驗方法，為進一步設計和開發(fā)高效低毒的亞硝基脲類抗癌新藥提供了依據(jù)。

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