溫瑞塘河沉積物的生物毒性表征研究

宋 力,蔣桂芳,黃民生,李 強(.重慶市環(huán)境材料與修復技術重點實驗室,重慶 40260；2.華東師范大學資源與環(huán)境學院,上海 200062)

溫瑞塘河沉積物的生物毒性表征研究

宋 力1,2,蔣桂芳1*,黃民生2*,李 強1(1.重慶市環(huán)境材料與修復技術重點實驗室,重慶 402160；2.華東師范大學資源與環(huán)境學院,上海 200062)

利用淡水型發(fā)光細菌青海孤菌的一個變種 Q67和熱帶爪蟾胚胎對溫瑞塘河沉積物浸出液生物毒性檢測分析.沉積物相對發(fā)光強度平均值為63.3%,屬中等生物毒性,最高發(fā)光強度為81.9%,最低發(fā)光強度為40.6%.沉積物浸出液的發(fā)育毒性結果為胚胎平均孵化率75.98%,最低點為42.5%,最高點為100%;胚胎成活率平均值為83.77%,最低值為66.25%,最高值為100%;平均致畸形率為16.6%,4個采樣點無致畸現(xiàn)象,最大致畸性率為36.3%;爪蟾的平均體長為3.58cm,最小體長2.64cm,最大體長4.06cm.工業(yè)園區(qū)、城市生活與工廠混雜區(qū),河流交匯且易于沉積區(qū)域生物毒性大,在源頭區(qū)及單一生活污染區(qū)生物毒性小.

發(fā)光細菌；熱帶爪蟾胚胎；沉積物；生物毒性；溫瑞塘河

河流、湖泊沉積物是污染物的“源”與“匯”,污染物在風浪或外力作用下再懸浮從而影響河流與湖泊的水質[1].沉積物中有毒有害物質的含量常被用作判斷河流湖泊水環(huán)境質量標準[2].生物毒性測試直接測定沉積物毒性大小,評價污染物在河道累積對水環(huán)境產(chǎn)生的生物毒性,是研究水體污染的一種重要手段[3].溫瑞塘河是典型的城市平原河網(wǎng),集景觀、運輸、農(nóng)業(yè)灌溉、飲用水于一體,流域內(nèi)是溫州市人口與工業(yè)聚集區(qū),皮革及其制品、機械制造與五金、服裝與印染、塑料制品、電鍍等中小企業(yè)十分發(fā)達.大量的污染物直接排入或隨地表徑流進入到溫瑞塘河網(wǎng)水系之中,溫瑞塘河河網(wǎng)(2007～2011)的水質監(jiān)測斷面多數(shù)處于劣Ⅴ類[4].目前對溫瑞塘河的研究主要是對沉積物重金屬污染及水體污染的評價[1],楊波[5],陳瑞瑞等[6]針對支流九山河、山下河進行生物毒性的研究,而針對整個流域的生物毒性的研究未見報道.

發(fā)光細菌作為指示生物開展生物毒性檢測分析,具有簡便、快速、靈敏、廉價等優(yōu)點,目前應用廣泛[7-8].爪蟾胚胎致畸實驗(Frog Embryo Teratogenesis Assay-Xenopus, FETAX)主要通過分析胚胎的孵化率、存活率、畸形率和生長抑制等指標表征樣品的毒性強弱[9-10].

為了揭示與深入分析溫瑞塘河流域沉積物受污染的生物毒性大小,利用淡水型發(fā)光細菌青?；【?Vibrio qinghaiensis sp.nov)的一個變種Q67和熱帶爪蟾(Xenopus tropicalis)胚胎進行生物毒性檢測分析,以期為溫瑞塘河治理特別是是否清淤提供參考依據(jù).

1 樣品采集

采樣時間為 2011年 4月 22～27日,利用TATO天泰正合MM9手持GPS定位儀定位,在溫瑞塘河流域共設置29個采樣點,采樣點見圖1.柱狀采樣器(可采深度≥50cm)采樣,并遵循河流采樣技術導則(HJ/T52-1999).

圖1 溫瑞塘河采樣點示意Fig.1 Sampling sites in Wenruitang River basin

2 實驗部分

2.1 測試生物

青?；【?Q67菌樣(vibrio qinghaiensis),熱帶爪蟾胚胎.

2.2 沉積物浸出液提取

2.2.1 發(fā)光細菌試驗 按沉積物與超純水的質量比1:3稀釋,常溫振蕩12h,靜置12h,取上清液作為沉積物浸出液進行發(fā)光細菌測試[11].

2.2.2 熱帶爪蟾胚胎致畸試驗 按沉積物與熱帶爪蟾養(yǎng)殖用水(自來水經(jīng)市售凈水器處理),按照1:4的體積比混合后裝入500mL的棕色瓶中,密封后置于振蕩機上振蕩 24h,震蕩機的條件控制設置為:100r/min,常溫.然后靜置24h,提取上清液進行實驗[5,16].

2.3 利用胚胎進行生物毒性實驗

2.3.1 胚胎的獲取 挑選性成熟熱帶爪蟾8對,人工注射絨毛膜促性腺激素(HCG)誘導產(chǎn)卵.每對爪蟾均注射2次HCG;挑選NF10～11階段且發(fā)育正常的胚胎進行實驗.

2.3.2 胚胎生物毒性測試 采用24孔板的培養(yǎng)皿進行胚胎培養(yǎng)實驗,以養(yǎng)殖用水為對照,實驗組和對照組各設4個平行,每個平行樣選取10個挑選胚胎.胚胎暴露條件:多功能培養(yǎng)箱,25℃,24h更換1次培養(yǎng)暴露液,在24h后將未孵化的胚胎挑出,并記錄胚胎孵化數(shù),在48h后統(tǒng)計孵化后胚胎存活數(shù)與死亡數(shù).將存活胚胎用 100mg/L MS-222麻醉液處理并固定于4%的甲醛溶液中.取固定在甲醛溶液的胚胎,在 Nikon解剖鏡下觀察胚胎的生長發(fā)育狀況,采用NikonDS-SM型顯微鏡拍攝系統(tǒng)進行拍照.

2.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 孵化率為 24h后孵化胚胎個數(shù)的百分比;存活率為48h后存活胚胎個數(shù)的百分比;體長:胚胎頭部至尾尖的水平距離;畸形率:48h后胚胎畸形個體數(shù)占總存活個體數(shù)的百分比.本實驗數(shù)據(jù)用SPSS16.0和origin8.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析.

2.4 利用發(fā)光細菌測試實驗方法

1) 取菌種凍干粉加入質量濃度為 3%生理鹽水10mL中,充分搖勻后,放置在20℃下30min左右進行細菌復蘇制備菌液;取 2mL測試液,依次加入 20μL菌液至測試管中,充分混勻,每隔15min左右,用BHP9511型水質毒性分析儀測定其相對發(fā)光率,并以2mL的3%生理鹽水作為空白對照組,每個測試樣設置3組平行樣.

2) 采用 EC50法對所得的生物毒性的數(shù)據(jù)進行有效分析評價.用直線內(nèi)插法求出相對發(fā)光率為50%時所對應的待測水樣中ZnCl2的濃度,利用 ZnCl2的濃度來評價各待測水樣的毒性大小.Y=-16.056χ+96.068,其中 R2=0.9716,相對發(fā)光強度計算如式(1).

從圖4可以看出,隨著通信半徑的增加,網(wǎng)絡連通性提高,所以各算法的平均定位誤差均降低,本文定位算法平均定位誤差始終保持最小,優(yōu)于其他算法?？梢钥闯鲈谙嗤亩ㄎ徽`差下,本文算法所需要的通信半徑最小,通信半徑越小,能耗越小,在同等條件下,本文算法可以節(jié)約能耗,延長網(wǎng)絡壽命,降低網(wǎng)絡維護成本。

式中:I為相對發(fā)光強度;L1為正常發(fā)光強度;L2為與毒物作用后的發(fā)光強度.

其中毒性評價標準見表1.

表1 毒性評價分級標準[11]Table 1 rating standard of toxicity[11]

3 結果與討論

3.1 發(fā)光細菌測試沉積物的生物毒性分析

由圖 2可知,溫瑞塘河沉積物相對發(fā)光強度的平均值 63.3%,最高發(fā)光強度為 81.9%,最低發(fā)光強度為 40.6%,其生態(tài)毒性評價中處于較大毒性的點有4個點,分別是1#、2#、7#、8#點這些點處于機械工業(yè)園區(qū),與城市河道交匯區(qū). 22#,23#,24#處于輕微毒性,位于溫瑞塘河源頭區(qū),受工業(yè)生產(chǎn)和生活污染相對較小,其余22個樣點處于中等生物毒性等級,由于溫瑞塘河屬于典型的平原城市河網(wǎng),水流相對較緩慢,污染物易于沉積,同時受到工業(yè)生產(chǎn)和城市生活污染的雙重影響現(xiàn)象明顯,污染物的組成成分復雜,再加上曾經(jīng)的管理落后等歷史原因,導致其沉積物的污染較重,特別是重金屬的影響,劉贊[12],雷炳莉[13]的相關研究也證實沉積物受污染的污染物組成越復雜其生物毒性也越強. Ho等[14]的研究結果顯示,沉積物產(chǎn)生生物毒性主要受到氨氮、有機物和重金屬 3類物質的影響,產(chǎn)生生物毒性的比例為有機物占8%,有機物+氨氮+重金屬占8%,有機物+氨氮占 23%,有機物+重金屬占 8%,氨氮+重金屬占15%,重金屬占15%.董小蓉等[15]研究指出水中微量有機污染物能對生物形成致畸變,產(chǎn)生生物毒性.王子健等[16]指出沉積物生物毒性大小受污染物質影響種類有待進一步細化,實驗用測試生物根據(jù)其敏感性對受試物質也有待進一步研究.

圖2 沉積物生物毒性分析與評價等級Fig.2 Sediment analysis and evaluation of biological toxicity

3.2 沉積物提取液對爪蟾胚胎孵化率的影響

由圖 3可知,沉積物提取液對爪蟾胚胎孵化產(chǎn)生影響,孵化率最低的點僅為 42.5%,孵化率最高點為100%,平均孵化率75.98%.根據(jù)單因子方差分析實驗組與對照組比較,存在顯著性差異點21個點,而其中在 2#點,孵化率為 0,其結果占約75%的樣點對爪蟾胚胎的孵化產(chǎn)生影響.在熱帶爪蟾胚胎外側有保護膜組織,胚胎受精后保護膜組織會逐步分解,在本研究中可能存在保護膜對熱帶爪蟾胚胎孵化產(chǎn)生保護作用,胚胎的整體孵化率較高,部分點的孵化率達到 100%,但是在一些點,沉積物提取液對兩棲類胚胎存在較強的發(fā)育毒性.1#、7#、8#、25#、26#、27#、28#點處在城市河道人口聚集區(qū)域,及河道交匯區(qū)與工業(yè)區(qū)域,其污染物來源相對復雜,生物毒性較大,導致胚胎的孵化率存在顯著性的差異.不具有顯著差異性的點11#、21#、22#、23#、24#、25#,均處于溫瑞塘河源頭區(qū),農(nóng)業(yè)區(qū)的孵化率高,與其污染物相對單一,主要受農(nóng)業(yè)與生活的污染,污染程度相對低.楊波[5]在對溫瑞塘河支流山下河、九山河沉積物及長江口沉積物利用爪蟾胚胎的檢驗與本研究有相似的結論,復雜的污染環(huán)境對胚胎孵化產(chǎn)生影響.

圖3 暴露于沉積物提取液48h后熱帶爪蟾胚胎的孵化率Fig.3 Effects of sediment extracts on hatching of embryos of amphibian (Xenopus tropicalis) after 48h of exposure Each vertical bar represents a mean of four replicates, and error bar represents standard deviation

3.3 對爪蟾胚胎成活率的影響

由圖 4可知,胚胎的成活率最低值 66.25%,成活率最高值為100%,平均值83.77%,單因素顯著性分析顯示 1#、7#、8#、27#、28#呈極顯著性差異,9#、18#、26#呈顯著性差異,其余各點成活率與對照組無明顯差異,沉積物提取液對成活率影響不明顯,可能存在實驗中對胚胎是否孵化認定,對孵化不明顯的胚胎去除,優(yōu)質爪蟾胚胎孵化后對毒性的耐受性提高,成活可能性增大.

圖4 暴露于沉積物提取液48h后熱帶爪蟾胚胎的成活率Fig.4 Effects of sediment extracts on survival of amphibian (Xenopus tropicalis) embryos after 48h of exposure

圖5 暴露于沉積物提取液48h后熱帶爪蟾胚胎的畸形率Fig.5 Teratogenic effects of sediment extracts on embryos of amphibian (Xenopus tropicalis) after 48h of exposure

由圖 5可知,溫瑞塘河沉積物提取液平均致畸形率為 16.6%,最小畸形率為 0,最大致畸性率為 36.3%.其結果整體的平均值比楊波等[5]對山下河、九山河的研究結果偏小.在本研究中山下河與九山的結果為13.9%和20.4%其春季的結果一致.具有極顯著性點 7#、8#、9#、28#、19#,這些點的沉積物的重金屬污染評價屬于污染嚴重等級,污染嚴重的區(qū)域,其致畸率相對較高.在本研究中,發(fā)現(xiàn)的主要畸形現(xiàn)象如圖6.

圖6 熱帶爪蟾胚胎48h后主要的畸形表型Fig.6 Major malformation phenotypes of Xenopus tropicalis after 48h for exposure

在暴露組中能夠觀察到各種類型的畸形特征,主要的畸形表型包括:眼睛畸形、軀干腫大、心包水腫、背鰭變窄、脊索彎曲、泄殖腔擴張、泄殖腔腫大、皮膚色素減少、皮膚色素沉著、發(fā)育延遲等現(xiàn)象,在畸形現(xiàn)象表征中,在一個胚胎生長發(fā)育中也表現(xiàn)出多種畸形現(xiàn)象如色素減輕,泄殖腔腫大、眼睛受損、尾鰭變窄等.這與Shi等[17]、陳瑞瑞等[6]在研究長江口沉積物與溫瑞塘河山下河、九山河的研究結果具有相似性,由于沉積物樣品組成物質的復雜性和多變性,導致其畸形的主要因素確定具有難度.

3.5 對爪蟾胚胎生長體長的影響

由圖7可知,爪蟾的平均體長為3.58cm,最小體長2.64cm,最大體長4.06cm.與對照組的單因子顯著性分析顯示,在4#、21#、22#、24#、25#點體長不具有顯著的差異性,這些點均處于溫瑞塘河的源頭區(qū)與農(nóng)業(yè)區(qū)域,受污染相對較小,污染物也單一.其中有22個采樣點均存在顯著性差異,溫瑞塘河沉積物79%的采樣點提取液對爪蟾胚胎生長產(chǎn)生影響.這些點處于受工業(yè)生產(chǎn),及生活的影響,但位于城市生活區(qū)20#點爪蟾胚胎體長無差異,可能提取液中的毒性物質在抑制胚胎,楊波[5]在研究九山外河的實驗中也發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象存在.

圖7 暴露48h后沉積物提取液對熱帶爪蟾胚胎生長的影響Fig.7 Effects of sediment extracts on growth of amphibian (Xenopus tropicalis) embryos after 48h of exposure

4 結論

4.1 溫瑞塘河沉積物相對發(fā)光強度的平均值63.3%,屬于中等生物毒性,最高發(fā)光強度為81.9%,最低發(fā)光強度為40.6%.

4.2 對青?；【?Q7)產(chǎn)生生物毒性在區(qū)域分布中,工業(yè)園區(qū)、城市與工廠混雜區(qū)域高于源頭區(qū)及農(nóng)業(yè)區(qū)域.

4.3 熱帶爪蟾平均孵化率 75.98%,最低點孵化率為 42.5%,最高點孵化率為 100%;胚胎的成活率平均值 83.77%,最低成活率為 66.25%,最高成活率為100%;平均致畸形率為16.6%,4個采樣點無致畸現(xiàn)象,最大致畸性率為 36.3%;爪蟾的平均體長為 3.58cm,最小體長 2.64cm,最大體長4.06cm.

4.4 在污染源復雜與污染嚴重區(qū)域如工業(yè)園區(qū)與城市生活區(qū),河流交匯易于沉積的區(qū)域對爪蟾胚胎的發(fā)育生長影響大,在河流的源頭區(qū)及污染源單一生活污染區(qū)域的影響小.

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致謝：本論文實驗中發(fā)光細菌與熱帶爪蟾胚胎由華東師范大學朱文杰教授、施華宏研究員友情提供,碩士研究生楊波參與部分實驗,在此表示感謝.

Biotoxicity characterization of sediments from Wenruitang River

SONG Li1, JIANG Gui-fang1*, HUANG Ming-

The biotoxicity of sediments from Wenruitang River was characterized and analyzed using luminescent bacteria Vibrio qinghaiensis sp. Nov-Q67 and Xenopus tropicalis embryos. The maximum, minimum and average luminous intensity of Q67was 81.9%, 40.6% and 63.3%, respectively, which indicated moderate biotoxicity. In terms of the developmental toxicity of the sediment leachate, the average, maximum and minimum hatching rate of the Xenopus tropicalis embryos was 75.98%, 100% and 42.5%, respectively. The average, minimum and maximum survival rate of the embryos was 83.77%, 66.25% and 100%, respectively. Four sites among all sampling points did not show embryos malformations. The average and maximum teratogenic rate of the embryos was 16.6% and 36.3%. The average, minimum and maximum body length of the embryos was 3.58, 2.64 and 4.06cm, respectively. Sediments collected from combined industrial and residential area exhibited significant biotoxicity, while sediments from the river source area and/or isolated residential area had relatively low biotoxicity.

luminescent bacteria；Tropicalis xenopus embryos；sediment；biological toxicity；Wenruitang River

X171.5

A

1000-6923(2014)09-2374-06sheng2*, LI Qiang (1.Chongqing Key Laboratory of Environmental Material and Remediation Technologies, Chongqing 402160；2.College of Resources and Environmental Science, East China Normal University, Shanghai 200062). China Environmental Science, 2014,34(9)：2374～2379

宋 力(1979-)男,重慶酉陽縣人,講師,博士,主要從事水資源利用與水環(huán)境污染控制的研究工作.發(fā)表論文10篇.

《中國環(huán)境科學》2012年度引證指標

《中國環(huán)境科學》編輯部

2014-01-20

國家科技重大水專項(2009ZX07317-006);重慶市教委項目(KJ121207);重慶文理學院科研項目(Y2010HH46)

* 責任作者, 講師, songlicq@163.com,教授,mshuan@des.ecnu.edu.cn

根據(jù)《2013年版中國科技期刊引證報告(核心版)》,《中國環(huán)境科學》2012年度引證指標繼續(xù)位居環(huán)境科學技術及資源科學技術類科技期刊前列,核心影響因子1.657,學科排名第1位,在被統(tǒng)計的1994種核心期刊中列第21位;綜合評價總分72.0,學科排名第3位.《中國科技期刊引證報告》每年由中國科學技術信息研究所編制,統(tǒng)計結果被科技管理部門和學術界廣泛采用.