湘蓮腐敗病菌的鑒定和抑菌藥劑篩選

， ，，

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/植物病蟲害生物學(xué)與防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410128)

蓮藕是促進(jìn)立體農(nóng)業(yè)發(fā)展，整合農(nóng)、林、牧、漁產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的一種重要水生作物品種[1]。湘蓮是湘潭市最富特色及最具增長潛能的產(chǎn)業(yè)，其年種植面積3 400～4 000 hm2，總產(chǎn)5 000 t左右。在湘蓮產(chǎn)業(yè)做大做強(qiáng)的過程中，湘蓮腐敗病的問題也日趨嚴(yán)重?？刂圃摬〔粌H是廣大種植湘蓮農(nóng)戶的迫切要求，同時也是湘蓮持續(xù)發(fā)展的需要[2]。為加強(qiáng)對湘蓮腐敗病的綜合防治，本研究對湘蓮腐敗病病原菌進(jìn)行鑒定，以了解相關(guān)生物學(xué)性狀；并選擇生產(chǎn)中常用的農(nóng)藥，包括百菌清、多菌靈、福美雙等，對湘蓮腐敗病病原菌生長抑制作用進(jìn)行測定，以找到最適藥劑和相應(yīng)的濃度，為湘蓮腐敗病的綜合治理策略的制定提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 湘蓮腐敗病病原菌鑒定

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病藕樣品采集

選取湖南省湘潭縣花石鎮(zhèn)粒粒珍湘蓮生產(chǎn)基地中發(fā)病蓮的種藕。采取的病樣埋于土壤表層及以下5～15 cm。

1.1.2 試劑與藥品

甲醇為HPLC醇(Tedia公司)，二甲基亞砜(國藥集團(tuán))，酵母粉，蛋白胨粉，瓊脂粉，試驗(yàn)所需無機(jī)鹽。

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基(g/L): 葡萄糖粉20，馬鈴薯200，瓊脂粉18，自然pH。

固體LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10，酵母粉5，氯化鈉10，瓊脂粉18，調(diào)節(jié)pH至7.0～7.3。

1.1.4 引物

采用16S rDNA通用引物，序列由上海生工合成并提供，5’端引物5’- AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’; 3’端引物5’-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3’。從北京全式金生物技術(shù)有限公司購進(jìn)Taq酶、dNTP及各類試劑盒。

1.1.5 主要儀器

PCR檢測儀器：ABI應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；顯微鏡帶熒光(80I)：尼康電器有限公司；強(qiáng)壓蒸汽除菌鍋：三洋電器有限責(zé)任公司；臺式冷凍離心機(jī)(Micro17R)：賽默飛世爾公司；超凈工作臺(SW-CJ-2G)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；凝膠成像儀(H6ZO812M)：protein simple；恒溫振蕩器(IS-RDH1)：Crystal；電熱恒溫箱(DHP-9082A)：上海飛越試驗(yàn)儀器有限公司；干燥箱(101A-2)：江南儀器儀表有限公司；電泳儀(TY0736)：伯樂生命科學(xué)產(chǎn)品有限公司；冰浴器(ICE01)：明日百傲科技有限公司；迷你微離心機(jī)(MiniStar)：托莫斯科學(xué)儀器有限公司； 冰箱(BCD-211we)：海爾股份有限公司；渦旋震蕩器：其林貝爾精密儀器儀表制造有限公司；電子天平: SHIMADZU。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離和純化

將感染湘蓮腐敗病的蓮藕樣品洗凈，切下5 cm長藕段先用無菌水漂洗一次，從罹病藕的病健交界處切取若干塊約1.0 cm×1.0 cm×0.4 cm的病組織。用0.1%升汞溶液消毒處理3.5 min，反復(fù)用清潔無菌水清洗4次，然后置于滅菌濾紙上。用手術(shù)刀切成小塊，將帶有湘蓮腐敗病病菌的小塊組織接種于PDA平板上(含氨芐青霉素50 mg/L，pH=7)，25℃培養(yǎng)7 d。用接種針挑取少量從病組織長出的真菌，用PDA繼代培養(yǎng)，再用平板劃線法進(jìn)行菌落分離[4，5]。

1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

根據(jù)病害癥狀、菌落形態(tài)大小、孢子、菌絲形狀長短等的特征來確定病原菌的種屬。病菌鑒定方法：根據(jù)單孢子菌落直徑、產(chǎn)生分生孢子的方法、分生孢子的形狀大小、是否有厚垣孢子等方面，從形態(tài)學(xué)上進(jìn)行鑒別[6]。

1.2.3 主要病原真菌ITS序列分析

(1)PCR擴(kuò)增。提取DNA，將培養(yǎng)基上的菌絲加50 μL無菌水用鑷子搗碎。經(jīng)冰浴2 min后，隨之沸水浴1 min。如此重復(fù)3次后離心(12 000 r/min)。PCR反應(yīng)體系總體積為200 μL。其中：EsayTaq Duffer 20 μL，正引物4 μL，反引物4 μL，模板4 μL，dNTPs 3 μL，taq酶3 μL，加ddH2O至200 μL。在離心管中用槍頭輕輕吸取混勻，分裝為4個50 μL的PCR管。采用ITS通用引物ITS1和ITS4(ITS1：5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3；ITS4：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得ITS序列。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 5 min，94℃變性30 s，55℃退火40 s，72℃延長60 s；40個循環(huán)；最后于72℃延伸10 min，保溫于4℃。檢驗(yàn)：取PCR產(chǎn)物5 μL和Loading Bμffer 3 μL混勻于1.2%的瓊脂糖膠(含1 μL/mL的GelStain)上，用穩(wěn)定電壓110 V電泳30 min。

(2)PCR產(chǎn)物的純化(使用EasyPure PCR Purification Kit試劑盒)。加40 mL100%乙醇到10 mL WB，取100 μL PCR產(chǎn)物，加入5倍容積的液體BB，充分?jǐn)噭蚝蠓湃胛街?，靜置1 min，10.000*g離心60 s,棄去流出液。加進(jìn)650 μL WB，10.000*g離心1 min，棄去流出液。10,000*g離心1 min，去除殘留的WB。在清潔的離心管中置入吸附柱，中心放入30 μL EB。洗脫DNA，于-20℃度保存。檢驗(yàn)：取PCR產(chǎn)物5 μL和Loading Buffer 3 μL混合均勻在1.2%的瓊脂糖膠(含1μL/mL的GelStain)上，用穩(wěn)定電壓100 V電泳55 min。用紫外線測定器觀察分析并照相。

(3)克隆(使用pEASY-T3 Cloning Kit試劑盒)反應(yīng)體系的鑒定。將PCR產(chǎn)物0.4 μL加pEASY-T3 Cloning Vector 1 μL，常溫下混勻5 min，反應(yīng)結(jié)束后在冰上放置。轉(zhuǎn)化：將連接產(chǎn)物與50 μL Trans1-T1的感受態(tài)細(xì)胞混合，在感受態(tài)細(xì)胞剛剛解凍時加入，輕彈混勻，冰浴20 min。42℃溫度下熱激30 s，馬上放于冰上2 min。加250 μL室溫的LB，200 rpm，37℃孵育1 h。取8 μL IPTG與40 μL 20 mg/mL X-gal混合，均勻涂在預(yù)備的平板上，37℃溫度下靜置30 min。設(shè)置一個對照組，不放X-gal。取200 μL菌液，4 000 rpm離心60 s，部分上清液棄去。懸浮菌液經(jīng)微彈，全部菌液用于涂板，37℃培養(yǎng)過夜。

(4)陽性重組子的鑒定。挑選6個白色克隆并編號，分別用10 μL無菌水稀釋，渦旋混勻。取1 μL菌液做模板，在25 μL PCR反應(yīng)體系下，以M13的正引物和反引物進(jìn)行擴(kuò)增，對重組子鑒定。PCR參照擴(kuò)增反應(yīng)條件。檢驗(yàn)：取PCR產(chǎn)物5 μL和Loading Bμffer 3 μL混勻于1.2%的瓊脂糖膠(1 μL/mL的GelStain)，用穩(wěn)定電壓100 V電泳55 min。用紫外線測定器觀察分析并照相。

(5)擴(kuò)增。取4個50 mL燒瓶分別加20 mL的BL培養(yǎng)基(加40 μL 50 mg/mL的氨芐青霉素)，分別加入有陽性反應(yīng)的菌落，200 rpm37℃過夜培養(yǎng)。擴(kuò)大培養(yǎng)以后送往鉑尚生物技術(shù)有限公司長沙測序部 C1測序。測序結(jié)果經(jīng)校對后，采用BLAST軟件，在序列雷同性方面進(jìn)行對比搜索, 找出同源性稍高的相近序列，然后使用MEGA 4.0軟件以相鄰法(Neighbor-Joning) 建成系統(tǒng)發(fā)育樹，探究之間的親緣聯(lián)系。

1.2.4 致病性測定

采用柯赫氏法則開展。將分離純化的單菌落用于藕塊接種。

各供試菌種在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，在無菌情況下，用7 mm無菌打孔器由外向內(nèi)取餅，在藕塊中心接種，注意朝下應(yīng)為菌絲面，接種完成后在28℃溫度條件下的培養(yǎng)箱中對藕塊進(jìn)行保濕培養(yǎng)，5 d后拍照[7]。

1.3 結(jié)果與分析

1.3.1 病原菌分離

分離到的病原菌株XL菌絲白色，菌落圓形，呈輻射狀，初白色，后呈紫色或紫紅色，菌落邊緣無色,如圖1。

圖1 分離到的病原菌株XL

1.3.2 形態(tài)學(xué)觀察

在電子顯微鏡下觀察到菌絲發(fā)達(dá)，透明無色，有隔，有分枝，如圖2。

圖2 病原菌株XL的菌絲

在電子顯微鏡下觀察到孢子形狀不一，一般為橢圓形、圓柱狀或略呈彎曲狀，無色，單孢，如圖3。

圖3 病原菌株XL的孢子

1.3.3 ITS分析

(1) PCR擴(kuò)增結(jié)果圖與藍(lán)白斑培養(yǎng)基圖。經(jīng)引物ITS1和ITS4 PCR擴(kuò)增完畢后，可獲得一600 bp上下的條帶，如圖4。

圖4 PCR純化產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果

以pEASY載體為載體克隆后篩選到陽性重組子，出現(xiàn)藍(lán)色和白色的菌落，如圖5。

圖5 克隆藍(lán)白斑培養(yǎng)基圖

(2)測序與分析。病原ITS序列測序結(jié)果如下：

AGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTT TACAACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCACTTGTT GCCTCGGCGGATCAGCCCGCTCCCGGTAAAACGGG ACGGCCCGCCAGAGGACCCCTAAACTCTGTTTCTAT ATGTAACTTCTGAGTAAAACCATAAATAAATCAAAA CTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGA AGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGC AGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACAT TGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCG AGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCCTCGGGTTTGGTG TTGGGGATCGGCGAGCCCTTGCGGCAAGCCGGCCC CGAAATCTAGTGGCGGTCTCGCTGCAGCCTCCATTG CGTAGTAGTAAAACCCTCGCAACTGGAACGCGGCG CGGCCAAGCCGTTAAACCCCCAACTTCTGAATGTTG ACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAG CATATCAATAAGCGGAGGA

將檢測的序列結(jié)果與GenBank中的16S rDNA序列通過Blast軟件，進(jìn)行同源性比對。采用Clustalx2.0對在NCBI查找的具有同源性的基因序列進(jìn)行多序列比對，采取鄰位相連法在軟件Mega4.0中建立系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，可知相似度最高的是尖鐮孢菌。病原菌株XL的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖6。

圖6 病原菌株XL的系統(tǒng)發(fā)育樹

1.3.4 致病性回接試驗(yàn)

接種5 d后藕塊表面呈褐色,剖面莖部可見近中心的維管束變淺褐色至黑褐色，如圖7。

圖7 霉菌菌株R1的菌絲

2 不同藥劑對湘蓮腐敗病病原菌的抑制作用

2.1 試驗(yàn)材料

2.1.1 供試材料

本實(shí)驗(yàn)室分離的湘蓮腐敗病病原菌。

2.1.2 供試藥劑

表1 6種農(nóng)藥的有效成分、生產(chǎn)廠家和劑型

培養(yǎng)基和主要儀器同前。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 強(qiáng)致病性菌株的篩選

采用病原菌菌絲塊接種藕塊的篩選方法，將接種的藕塊置于28℃培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，5 d后測定發(fā)病病斑的大小和發(fā)病藕塊的數(shù)量。選擇發(fā)病率最高、所致病斑最大的病原菌作為供試菌株[8]。

2.2.2 常用化學(xué)藥劑對腐敗病菌的室內(nèi)毒力測定

采用生長速率法用藥劑對病原菌毒力的大小進(jìn)行測定：將供試藥劑依據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，用無菌水調(diào)配成濃度適宜的且具有有效成分的母液，再將供試藥劑用巴氏消毒法滅菌(62℃水浴加熱30 min[5])，調(diào)配相對應(yīng)的濃度，化學(xué)藥劑的最終濃度分別為400×、500×、600×、700×等，取2 mL藥劑和18 mL融化的PDA混勻，靜置冷卻成平板。將篩選出的強(qiáng)致病性菌株在PDA上培養(yǎng)5～6 d后，用直徑7.0 mm滅菌打孔器取菌餅。將菌絲片接種在具有相應(yīng)濃度藥劑的PDA平板上，設(shè)空白滅菌培養(yǎng)基為對照。28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)后，用十字交叉法測量菌落直徑。以菌落直徑或半徑長短平均數(shù)值計(jì)算菌絲生長抑制比例。然后以藥劑濃度的對數(shù)為x，藥劑抑制率換算的幾率值為y，求得藥劑對蓮藕腐敗病菌的毒力回歸方程y=a+bx，并由方程計(jì)算各供試藥劑的抑制中濃度(EC50值)。根據(jù)各藥劑的抑制中濃度比較其對腐敗病菌毒力的大小。所用公式如下：

純生長量=菌落平均直徑-菌餅直徑

2.3 室內(nèi)毒力測定

供試農(nóng)藥對湘蓮腐敗病菌絲生長的抑制結(jié)果見表2。6種農(nóng)藥對湘蓮腐敗病菌的毒力回歸方程、抑制中相關(guān)系數(shù)r以及濃度(EC50)見表3。比較各供試藥劑的EC50值發(fā)現(xiàn)，6種農(nóng)藥對湘蓮腐敗病菌都有一定毒力，但毒力大小差異很大。其中50%硫磺·多菌靈的抑菌效果最好，EC50為19.87 μg/mL；其次為50%多菌靈WP，其EC50為104.11 μg/mL；此外，75%百菌清抑制效果較好，EC50值為108.85 μg/mL；25%腐霉·福美雙的效果較差，EC50為381.95 μg/mL；毒力最低的是50%福美雙WP，其EC50高達(dá)421.63 μg/mL。

表2 6種農(nóng)藥對湘蓮腐敗病菌絲生長的抑制效果

(續(xù)表2)

表3 各處理藥劑的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)和抑制中濃度

3 小結(jié)與討論

從湖南省湘潭縣花石鎮(zhèn)粒粒珍公司湘蓮生產(chǎn)基地中采集的帶病種藕上，通過分離、純化得到病原菌株。該菌落圓形，呈輻射狀，初白色，后呈紫色或紫紅色，菌落邊緣無色，菌絲白色。綜合形態(tài)學(xué)、16S rDNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，最終將湘蓮腐敗病病原鑒定為尖鐮孢菌。

通過菌絲體生長速率法，測定了生產(chǎn)中防治尖鐮孢菌所引起病害的常用化學(xué)農(nóng)藥對湘蓮腐敗病菌強(qiáng)致病株的室內(nèi)毒力。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同農(nóng)藥對湘蓮腐敗病菌都有一定毒力，但毒力大小差異很大。其中50%硫磺·多菌靈的抑菌效果最好，EC50為19.87 μg/mL，其次為多菌靈，福美雙的效果最差。這也許是由于各種農(nóng)藥的作用機(jī)制不同所致。目前雖然還沒有湘蓮腐敗病菌對農(nóng)藥產(chǎn)生抗藥性的報(bào)道，但為了延長高效農(nóng)藥的使用年限，避免該病原菌因產(chǎn)生嚴(yán)重抗藥性而降低藥效，應(yīng)根據(jù)所用藥劑的持效期，盡量減少用藥次數(shù)，并且交替使用作用機(jī)理不同的農(nóng)藥。但不同農(nóng)藥之間有無協(xié)同增效、交互抗藥性，還有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)結(jié)果雖然證明了化學(xué)藥劑對蓮藕腐敗病具有一定的防效，田間施用化學(xué)農(nóng)藥仍是控制蓮藕腐敗病的重要手段，所以有待繼續(xù)深入研究化學(xué)藥劑的田間防治，但在今后的研究中，應(yīng)進(jìn)一步對其它生物學(xué)特性進(jìn)行研究并提出新的防治方法，尤其探索有效的生物防治方法是今后研究的重點(diǎn)。

[1] 羅海莉，李 潔，嚴(yán)守雷，等.蓮藕貯藏期主要致病真菌分離鑒定及其致病相關(guān)酶酶學(xué)特征研究[J].長江蔬菜，2011，10(16)：68-72.

[2] 曾凡榮，曾敬富，桂良杰，等.蓮藕腐敗病的診斷及綜合防控技術(shù)初報(bào)[J].現(xiàn)代園藝，2010(8)：111-112.

[3] 方中達(dá).植病研究方法[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1979.634.

[4] 李志敏.蘋果腐爛病的發(fā)生與防治[J].河北農(nóng)業(yè)科技，1994(9)：27-28.

[5] 蔡信之，黃君紅.微生物學(xué)(第二版)[M].北京：高等教育出版社，2002.142.

[6] 魏景超，真菌鑒定手冊[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979.560.

[7] 梁志懷，魏 林，安哲宇.蓮藕腐敗病病原菌致病性及遺傳差異性的研究[J].長江蔬菜(學(xué)術(shù)版)，2010(14)：103-105.

[8] 梁志懷，魏 林，成燕清，等.不同殺菌劑對蓮藕腐敗病菌的室內(nèi)毒力測定及田間防治效果[J].長江蔬菜(學(xué)術(shù)版)，2011 (16)：60-63.