鎂合金對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及成骨分化的影響研究

張 濤，武肖娜，尹慶水，夏 虹，黃華揚(yáng)，張 余，李 梅，藍(lán)國波

鎂合金是新興可降解金屬材料，具有良好的降解性及生物相容性，近年來受到材料學(xué)界及醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。但是作為一種骨科植入材料，鎂合金對骨再生的關(guān)鍵細(xì)胞——骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的成骨分化過程是否存在影響，目前尚不明確。本研究采用鎂合金浸提液培養(yǎng)BMSCs并進(jìn)行誘導(dǎo)分化，研究其對BMSCs增殖活性及成骨分化性能的初步影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

DMEM低糖培養(yǎng)基、胎牛血清、2.5 g/L胰酶、PBS緩沖液（美國，Hyclone公司），CCK試劑盒（日本，同仁公司），DMSO（美國，Sigma 公司），Percoll淋巴細(xì)胞分離液（密度1.073 g/mL，美國，Gibico公司）。成骨誘導(dǎo)劑：1×10-8mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、0.2 mmo1/L L-抗壞血酸（美國，Sigma公司）。PrimeScriptRT reagent Kit Perfect Real Time（逆轉(zhuǎn)錄試劑盒）、SYBR Green Premix Ex Taq（熒光定量PCR試劑盒）、DNA上樣緩沖液、Trizol裂解液（日本，Takara公司）。

超純水機(jī)（美國，Aquapro公司）、酶聯(lián)免疫檢測儀（美國，Thermo公司）、4000型臺式低速離心機(jī)（日本，KUBOTA公司）、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國，F(xiàn)roma Scientific公司）、PCR儀（日本，TAKARA公司）、DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）、LightCycler 480熒光定量PCR儀（德國，Roche公司）、流式細(xì)胞儀（美國，BD公司）。

1.2 人BMSCs的分離培養(yǎng)及鑒定

常規(guī)無菌條件下從6名捐獻(xiàn)骨髓健康志愿者髂后上嵴穿刺抽取骨髓5 mL，再連接已肝素化處理的10 mL注射器針筒，迅速轉(zhuǎn)移至含5 mL Percoll的離心管，采用密度梯度離心法，將界面處一白色薄層（細(xì)胞層）吸出，轉(zhuǎn)移至另一離心管中，PBS液洗滌2次，棄去上清液后加入DMEM低糖培養(yǎng)液，輕吹打分散，制成細(xì)胞懸液。加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液2 mL，置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。取第3代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

收集培養(yǎng)細(xì)胞，取1×104個細(xì)胞用PBS液調(diào)整至100 μL，經(jīng)多聚甲醛固定后用流式細(xì)胞儀檢測CD34、CD45、CD44、CD73、CD90和CD105的表達(dá)情況[1]。

1.3 鎂合金浸提液的制備

根據(jù)ISO10993[2]，按材料表面積/浸提介質(zhì)為1.25 cm2/mL的比例，向裝有鎂合金AZ31B（中科院金屬所制備提供）的容器中加入含10%胎牛血清的L-DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，放于37℃CO2培養(yǎng)箱中孵育，浸泡24 h，提取液置4℃冷藏，24 h之內(nèi)使用。無涂層鎂合金浸提液的pH值較高（8.4～8.8），采用稀鹽酸調(diào)整其酸堿性能（7.3～7.5），稱之為pH-AZ31B組。

同樣根據(jù)ISO10993[2]材料表面積/浸提介質(zhì)比例標(biāo)準(zhǔn)，向裝有鎂合金的容器中分別加入含成骨誘導(dǎo)劑（1×10-8mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、0.2 mmo1/L L-抗壞血酸）和10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)基的成骨誘導(dǎo)液，置于37℃CO2培養(yǎng)箱中孵育，浸泡24 h，獲取具有誘導(dǎo)活性的條件浸提液。

1.4 CCK法檢測細(xì)胞增殖活性

將人BMSCs用0.25%胰蛋白酶消化，將1×104／L的細(xì)胞懸液200 μL接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后將培養(yǎng)液分別換為2組浸提液，對照組加入L-DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液。每2 d更換1次，分別培養(yǎng)1、3、5、7 d后棄浸提液，PBS清洗后加入CCK-820μL，同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定450 nm處的吸光度（optical density，OD）值。按公式計算相對增殖率：相對增殖率=（試驗(yàn)組OD值/對照組OD值）×100%，據(jù)此評價材料的細(xì)胞毒性分級[2]。

1.5 定量PCR檢測

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的細(xì)胞消化，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/L，每孔2 mL種植于6孔板中，每組3個復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，對照組更換培養(yǎng)液為含成骨誘導(dǎo)劑（1×10-8mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、0.2 mmo1/L L-抗壞血酸）和10%FBS L-DMEM培養(yǎng)基的成骨誘導(dǎo)液，實(shí)驗(yàn)組更換為條件培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。每2 d換液一次，培養(yǎng)至6、12 d時收集細(xì)胞。每孔加入1 mL Trizol裂解液裂解細(xì)胞，使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，合成cDNA，設(shè)置內(nèi)參基因（β-actin基因），進(jìn)行定量PCR檢測。于成骨分化誘導(dǎo)后6、12 d檢測各組ALP、COLⅠ和OPN基因的表達(dá)情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。各組間數(shù)據(jù)采用析因設(shè)計方差分析，多重比較應(yīng)用LSD法，方差不齊時采用Dunnetts T3比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs鑒定

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果提示CD34（—）、CD45（—）、CD44（+）、CD73（+）、CD90（+）、CD105（+）。

2.2 BMSCs細(xì)胞增殖活性

如圖1所示，AZ31B組細(xì)胞增殖能力顯著低于對照組（P＜0.05），pH-AZ31B組細(xì)胞增殖能力與對照組無明顯差異（P＞0.05）。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖活性

圖2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相對增殖率

如圖2所示，AZ31B組相對增殖率在培養(yǎng)7 d時＜80%，說明鎂合金有一定毒性，毒性評級為2級[2]；pH-AZ31B組細(xì)胞增殖活力在4個時間點(diǎn)均＞80%，毒性分級為1級[2]。AZ31B組細(xì)胞增殖率顯著低于對照組，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；pH-AZ31B組細(xì)胞增殖率與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 定量PCR檢測各基因表達(dá)量

2.3.1 COLⅠ基因表達(dá)情況 如圖3所示，隨著培養(yǎng)時間的延長，兩組COLⅠ基因表達(dá)逐漸增加；與BMSCs共培養(yǎng)6、12 d，AZ31B組COLⅠ基因表達(dá)量與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3.2 ALP基因 如圖4所示，與BMSCs共培養(yǎng)6、12 d，pH-AZ31B組ALP表達(dá)量與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；但未調(diào)整pH值的AZ31組ALP表達(dá)明顯低于對照組和pH-AZ31B組（P＜0.05）。結(jié)果提示pH值可能是鎂合金影響ALP基因表達(dá)的因素之一。

2.3.3 OPN基因 如圖5所示，與BMSCs共培養(yǎng)6、12 d，pH-AZ31B組OPN基因表達(dá)量與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；但未調(diào)整pH值的AZ31組OPN表達(dá)明顯高于對照組和pH-AZ31B組（P＜0.05）。結(jié)果提示pH值可能是鎂合金影響OPN基因表達(dá)的因素之一。

3 討論

3.1 BMSCs的鑒定

骨髓中的BMSCs含量很少，實(shí)際應(yīng)用時需要進(jìn)行分離純化和體外擴(kuò)增。目前用于分離BMSCs的方法主要有全骨髓貼壁法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀法和免疫磁珠法等，其中較為常用的是全骨髓貼壁法和密度梯度離心法。本研究采用密度梯度離心法進(jìn)行BMSCs的分離，然后行細(xì)胞培養(yǎng)，最終經(jīng)過鑒定來明確細(xì)胞的類型。

圖3 COLⅠ基因表達(dá)情況

圖4 ALP基因表達(dá)情況

圖5 OPN基因表達(dá)情況

常用的鑒定方法主要包括細(xì)胞形態(tài)鑒定、多向誘導(dǎo)分化鑒定、干細(xì)胞表面標(biāo)記物鑒定等，其中表面標(biāo)記物鑒定具有非專一性和種屬特異性，臨床應(yīng)用較為廣泛。MSCs可以表達(dá)多種細(xì)胞的表面標(biāo)志，以及多種細(xì)胞因子、黏附分子和生長因子的受體[3]。人MSCs與造血干細(xì)胞共同存在于骨髓中，但MSCs不表達(dá)典型造血細(xì)胞表面抗原，如造血干細(xì)胞標(biāo)志抗原CD34、白細(xì)胞標(biāo)志抗原CD45 等[4]，僅 表 達(dá) CD29、CD44、CD90、CD105、CD166等基質(zhì)細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志[5]，還有文獻(xiàn)報道，CD105+、CD73+、CD90+和CD45－、CD34－、CD14－這一細(xì)胞表型的細(xì)胞可提示為MSCs[6]。

本實(shí)驗(yàn)中CD34表達(dá)量極小，提示不表達(dá)造血細(xì)胞的表面標(biāo)志；CD45是泛白細(xì)胞標(biāo)志物，又稱白細(xì)胞共同抗原，其在MSCs表達(dá)較低，且在人工培養(yǎng)下很快失去陽性表達(dá)[6]，本實(shí)驗(yàn)第3代MSCs顯示CD45為陰性，與文獻(xiàn)報道一致。CD44為一種黏附分子，是骨橋蛋白和透明質(zhì)酸的受體，在骨髓組成中起重要作用，本實(shí)驗(yàn)CD44在MSCs表達(dá)呈強(qiáng)陽性，也證實(shí)其表型特異性[7]；CD105又稱轉(zhuǎn)化生長因子-β受體，是構(gòu)成細(xì)胞膜整體所必需的蛋白質(zhì)；CD73存在于淋巴細(xì)胞B細(xì)胞亞群和T細(xì)胞亞群、濾泡樹突細(xì)胞、上皮細(xì)胞等，可能是淋巴細(xì)胞的成熟標(biāo)志；CD90同時表達(dá)于腦和淋巴組織。本實(shí)驗(yàn)此4種抗原均呈強(qiáng)陽性表達(dá)，具有一定程度的特異性，證實(shí)所獲取BMSCs純度較高。

3.2 鎂合金對BMSCs增殖的影響

作為具有成骨作用的主要細(xì)胞之一，BMSCs主要應(yīng)用于成骨分化及評估材料的成骨性能[8-9]。鎂合金是近年來受到廣泛關(guān)注的一種新型金屬材料，對其生物相容性的評估目前主要采用成纖維細(xì)胞。隨著研究的逐步深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)鎂合金可用作骨科植入材料及心腦血管支架材料，因此開始采用成骨細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行生物相容性評價。但鎂合金對BMSCs生物學(xué)行為是否造成影響，目前相關(guān)報道不多。有學(xué)者采用BMSCs研究鎂合金表面的黏附性能[10]，Zhang等[11]應(yīng)用BMSCs進(jìn)行鎂合金的細(xì)胞毒性研究，結(jié)果顯示鎂合金浸提液對BMSCs具有細(xì)胞毒性作用，但經(jīng)過微弧氧化表面改性后，其生物相容性能改善明顯。上海交通大學(xué)的Yang等[12]采用人BMSCs進(jìn)行3種鎂合金材料的生物學(xué)性能研究，結(jié)果提示3種鎂合金均存在部分細(xì)胞毒性，但對其浸提液進(jìn)行pH值調(diào)整后，即表現(xiàn)出良好的增殖活性。

本研究鎂合金細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報道相似[11-12]，共培養(yǎng)7 d時存在2級細(xì)胞毒性，結(jié)合文獻(xiàn)及前期研究結(jié)果，我們設(shè)置調(diào)整pH值組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)調(diào)整pH值的鎂合金浸提液細(xì)胞毒性為1級，具有良好的生物相容性。

3.3 鎂合金對BMSCs成骨分化的影響

基因表達(dá)檢測結(jié)果提示，鎂合金組ALP基因表達(dá)量顯著降低，OPN基因表達(dá)量顯著增高；但消除浸提液酸堿性影響后的調(diào)整pH值浸提液組ALP和OPN基因表達(dá)量與對照組無顯著差異，提示浸提液的酸堿性能可能是影響成骨分化基因表達(dá)的重要因素。至于鎂合金對其他成骨分化基因及成骨作用是否造成影響，還有待于進(jìn)一步深入的研究。

綜上所述，BMSCs在鎂合金浸提液中具有較好的增殖活性，細(xì)胞毒性為2級；調(diào)整pH值后的鎂合金浸提液具有良好的生物相容性。提示鎂合金對于BMSCs成骨分化過程無不良影響，其產(chǎn)生的部分改變可能是鎂合金浸提液pH值影響所致。

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