長(zhǎng)白山區(qū)野生香薷中揮發(fā)油的提取及其抑菌性研究

江章濤++李富強(qiáng)++陳++晨+方凌玉+張永健+吳園園+于加平

摘要：采用水蒸氣蒸餾法對(duì)長(zhǎng)白山野生香薷中揮發(fā)油進(jìn)行提取，再用藥敏紙片法和二倍稀釋法進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，研究其抑菌活性。 結(jié)果表明長(zhǎng)白山野生香薷揮發(fā)油對(duì)細(xì)菌和真菌均有一定的抑菌效果。結(jié)果為進(jìn)一步開發(fā)長(zhǎng)白山野生香薷的藥用價(jià)值提供了良好的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：野生香薷；水蒸氣蒸餾法；揮發(fā)油；抑菌性

基金項(xiàng)目：吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（吉農(nóng)院合字［2013］第067號(hào)）；吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院微生物重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目（吉農(nóng)院合字［2013］第X005號(hào)）

中圖分類號(hào)：Q949 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)： 1674-0432（2014）-12-20-2

香薷（mosla herb）屬唇形科二年生草本植物,散發(fā)香氣，又叫香菜，是東北農(nóng)村傳統(tǒng)的食物調(diào)料，其香味極濃，可增強(qiáng)口感；香薷主要分布于江西、陜西、山東、甘肅和吉林等地，在我國資源豐富，其中以江西產(chǎn)量大，品質(zhì)佳，又稱“江香薷”。目前主要是對(duì)“江香薷”中的黃酮、多糖和揮發(fā)油進(jìn)行研究，而對(duì)長(zhǎng)白山區(qū)的野生香薷的揮發(fā)油的相關(guān)研究卻鮮見報(bào)道。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道揮發(fā)油具有鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒、解熱、緩解腸痙攣等功效 [1，2]。為了更好地研究、了解、利用長(zhǎng)白山野生香薷，本論文將以長(zhǎng)白山野生香薷為原料，采用水蒸汽蒸餾技術(shù)對(duì)其中的揮發(fā)油進(jìn)行提取，并利用藥敏紙片法和二倍稀釋法對(duì)其揮發(fā)油的抑菌性進(jìn)行研究，為長(zhǎng)白山區(qū)野生香薷的藥用價(jià)值的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1原料與試劑 長(zhǎng)白山野生香薷，采自吉林省長(zhǎng)白山區(qū)內(nèi)，經(jīng)專家鑒定為長(zhǎng)白山野生香薷，處理為干品，通過粉碎機(jī)制成干燥的香薷粉末。NaCl、無水 Na2SO4、乙醚為分析純。

1.1.2菌種 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、霉菌、青霉、黑曲霉、酵母以上菌種均由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3培養(yǎng)基采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。蛋白胨10.0克，牛肉浸膏5.0克，NaCl 5.0克，瓊脂20.0克， pH 7.2，121 ℃滅菌20分鐘。

1.1.4儀器與設(shè)備 揮發(fā)油提取器、FWl00型高速萬能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）、LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌器（上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司）、ZD-85氣浴恒溫振蕩培養(yǎng)箱（常州翔天實(shí)驗(yàn)儀器廠）、AIR-TECH型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1水蒸氣蒸餾法提取香薷揮發(fā)油 參考水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油的相關(guān)文獻(xiàn)[3，4]，準(zhǔn)確稱取100.00克干燥野生香薷粉末，置于揮發(fā)油提取器內(nèi)，連接水蒸氣蒸餾裝置后開始提取，收集餾出液，向餾出液中加入NaCl，靜置后用乙醚萃?。?0毫升×3次），合并萃取液，向萃取液中加入適量無水Na2SO4后，低溫干燥24小時(shí)后再進(jìn)行過濾，旋蒸回收乙醚，收集揮發(fā)油并計(jì)算揮發(fā)油得率，置于冰箱內(nèi)備用。

1.2.2菌懸液的制備 將供試的細(xì)菌和真菌的菌種接種到斜面培養(yǎng)基上活化，用無菌接種環(huán)從斜面上挑取各供試菌種，將其接種到液體培養(yǎng)基中，細(xì)菌菌種在溫度37℃、轉(zhuǎn)速220轉(zhuǎn)/分的條件下恒溫震蕩培養(yǎng)24小時(shí)，真菌菌種在溫度28℃、轉(zhuǎn)速220轉(zhuǎn)/分的條件下恒溫震蕩培養(yǎng)48小時(shí)，用無菌蒸餾水將供試菌進(jìn)行稀釋。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法，具體計(jì)算公式如下：1mL菌液中的總菌數(shù)/個(gè)=平均每個(gè)小格的總菌數(shù)×25×16×1000×稀釋倍數(shù)，分別調(diào)整至終濃度為106CFU/mL的菌懸液和104CFU/mL的孢子懸液，備用。

1.2.3藥敏紙片法測(cè)定抑菌圈 用無水乙醇將香薷揮發(fā)油母液分別稀釋成25毫克/毫升、15毫克/毫升和5毫克/毫升，置于3支不同的試管內(nèi)，備用。

打孔器將干凈的濾紙制成直徑為6毫米的小圓紙片，高溫蒸汽滅菌后，置于25毫克/毫升、15毫克/毫升和5毫克/毫升這3種不同質(zhì)量濃度的揮發(fā)油中浸泡2小時(shí)，再用無菌鑷子移至無菌平皿中，分別加入2~3滴這3種不同濃度的香薷揮發(fā)油，放在干燥箱內(nèi)烘干，制成飽和的藥敏紙片。在超凈工作臺(tái)上，將滅菌后的固體培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，每皿15毫升。待冷卻凝固后，用移液器吸取0.1毫升菌液至培養(yǎng)基平板上，用涂布器將菌液涂布均勻，然后正置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時(shí)（細(xì)菌培養(yǎng)溫度37℃，真菌培養(yǎng)溫度28℃）。1小時(shí)后，將飽和的藥敏紙片呈品字狀貼于平皿上，并設(shè)無水乙醇濾紙片作為空白對(duì)照，然后放在恒溫箱內(nèi)倒置培養(yǎng)。細(xì)菌置于37℃的恒溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)后觀察，測(cè)量并記錄抑菌圈的直徑；真菌置于28℃的恒溫箱中培養(yǎng)48小時(shí)后觀察，測(cè)量并記錄抑菌圈的直徑。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，取平均值。

以抑菌圈直徑的大小為參考指標(biāo)，根據(jù)抗菌物質(zhì)抑菌圈試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)[5]，得出如下的結(jié)論：抑菌圈直徑大于15毫米為高度敏感，抑菌性強(qiáng)；抑菌圈直徑在10~15毫米之間為中度敏感，抑菌性中等；抑菌圈直徑在7~9毫米之間為低度敏感，抑菌性弱；抑菌圈直徑小于7毫米為不敏感，無抑菌性。

1.2.4二倍稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）在無菌條件下，將14支滅菌試管，平均分成兩組，每組7支，一組用于測(cè)定細(xì)菌的MIC和MBC，另一組用于測(cè)定真菌的MIC和MBC。采用二倍稀釋法[6]，用無水乙醇將香薷揮發(fā)油母液分別稀釋成25.0000、12.5000、6.2500、3.1250、1.5625、0.78125毫克/毫升，將這6種不同濃度的揮發(fā)油分別加入到第1~6支試管中，往第7支試管中加入等量的無水乙醇。用移液器分別移取1毫升不同濃度的揮發(fā)油至無菌培養(yǎng)皿中，加入14毫升冷卻至45℃的瓊脂培養(yǎng)基（細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，真菌用馬鈴薯固體培養(yǎng)基），將藥液和培養(yǎng)基混勻，冷凝待用。將1毫升無水乙醇與14毫升冷卻至45℃的瓊脂培養(yǎng)基混合的稀釋劑設(shè)為對(duì)照組。

待培養(yǎng)基冷卻凝固后，吸取制備好的菌懸液或孢子懸液0.1毫升，將其均勻涂布于上述平皿表面，先放在恒溫箱中正置培養(yǎng)1小時(shí)（細(xì)菌37℃，真菌28℃）后，取出平皿，用封口膜包裝后，再放在恒溫箱中倒置培養(yǎng)（細(xì)菌37℃，24小時(shí);真菌28℃，24小時(shí)），然后觀察并記錄供試菌的生長(zhǎng)情況，與對(duì)照組進(jìn)行比較，生長(zhǎng)菌體的，記為陽性（+），不生長(zhǎng)菌體的，記為陰性（-）；以不生長(zhǎng)菌體的最小的揮發(fā)油濃度，記為香薷揮發(fā)油的最小抑菌濃度（MIC），將上述測(cè)出MIC的各菌液繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，此時(shí)不生長(zhǎng)菌體的最小的揮發(fā)油濃度，記為香薷揮發(fā)油的最小殺菌濃度（MBC)。

2 結(jié)果與分析

按1.2.1方法得長(zhǎng)白山野生香薷的含量為1.74%。

2.1 野生香薷揮發(fā)油抑菌活性的測(cè)定結(jié)果

按1.2.2，1.2.3方法測(cè)定野生香薷揮發(fā)油抑菌活性，結(jié)果見表1，表2。

表1 野生香薷揮發(fā)油對(duì)細(xì)菌的抑菌圈直徑測(cè)定結(jié)果（mm)

表2野生香薷揮發(fā)油對(duì)真菌的抑菌圈直徑測(cè)定結(jié)果（mm)

由表1和表2可以看出，野生香薷揮發(fā)油母液對(duì)6種供試菌的抑菌效果明顯不同，而且對(duì)細(xì)菌的抑菌強(qiáng)度和對(duì)真菌的抑菌強(qiáng)度是不同的。野生香薷揮發(fā)油對(duì)細(xì)菌的抑菌圈直徑隨濃度的增加而變大，而且對(duì)枯草桿菌的抑制效果最好，對(duì)大腸桿菌的抑制效果最差；香薷揮發(fā)油對(duì)真菌的抑菌圈直徑也隨濃度的增加而變大，并且對(duì)黑曲霉的抑制效果最好，對(duì)酵母的抑制效果最差。從表4可以得知，當(dāng)香薷揮發(fā)油的濃度為5毫克/毫升時(shí)，對(duì)酵母幾乎沒有抑制作用，不出現(xiàn)抑菌圈。從總體上看，野生香薷揮發(fā)油母液對(duì)6種供試菌的抑菌圈直徑大小關(guān)系為：枯草桿菌>金黃色葡萄球菌>黑曲霉>青霉>大腸桿菌>酵母，香薷揮發(fā)油對(duì)枯草桿菌、金黃色葡萄球菌均有較強(qiáng)的抑制作用，而對(duì)酵母有較弱的抑制作用。

2.2 野生香薷揮發(fā)油的最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC)的測(cè)定結(jié)果

按1.2.4，1.2.5方法測(cè)長(zhǎng)白山野生香薷揮發(fā)油的最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC)，結(jié)果見表3和表4。

由表3和表4可知：野生香薷揮發(fā)油對(duì)酵母的最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC)最大，對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌的最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC)最小，香薷揮發(fā)油對(duì)6種供試菌的最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC)是不同的，其測(cè)定的結(jié)果與抑菌圈直徑大小的測(cè)定結(jié)果是相符的。

野生香薷揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、酵母、青霉、黑曲霉的最小抑菌濃度分別為6.2500、3.1250、3.1250、12.5000、6.2500、6.2500毫克/毫升；最小殺菌濃度分別為12.5000、6.2500、6.2500、25.0000、12.5000、12.5000毫克/毫升?？偟膩碚f，香薷揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌的抑菌作用較強(qiáng)，對(duì)酵母的抑菌作用最弱。

表3 野生香薷揮發(fā)油的MIC（mg/mL）

表4 野生香薷揮發(fā)油的MBC（mg/mL）

3 結(jié)語

為了合理應(yīng)用長(zhǎng)白山區(qū)野生香薷這一寶貴資源，通過水蒸氣蒸餾技術(shù)提取香薷中的揮發(fā)油，并對(duì)其抑菌性進(jìn)行了研究。采用藥敏紙片法和二倍稀釋法，研究揮發(fā)油稀釋液的抑菌效果，觀察到香薷揮發(fā)油有明顯抑制菌斑生長(zhǎng)的作用，能有效抑制菌斑中細(xì)菌或真菌的生長(zhǎng)繁殖。體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，香薷揮發(fā)油對(duì)試驗(yàn)所選的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、酵母、青霉和黑曲霉這6種菌種均有明顯的抑菌效果，對(duì)酵母幾乎沒有抑菌作用。體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果為香薷揮發(fā)油在醫(yī)藥、食品等方面的應(yīng)用提供了依據(jù)。香薷揮發(fā)油的一些藥理作用與其化學(xué)成分有密切的關(guān)系，但作用機(jī)理目前尚不明確，還有待于進(jìn)一步探討。

參考文獻(xiàn)

[1] 金偉.長(zhǎng)白山野生香薷及其人工栽培技術(shù)[J].蔬菜,1997,(3):16.

[2] 衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典一部[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:196,附錄57.

[3] 陳根順,李鵬,陳陽.江香薷揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,(05)：61-63.

[4] 羅琴,李星,李洋.益智仁揮發(fā)油的水蒸氣蒸餾法提取工藝優(yōu)化及其體外抑菌活性的研究[J].華西藥學(xué)雜志,2011,26(2):147-149.

[5] 趙玉清,劉寶全,李慧,蔣本國.殼聚糖-Ag(Ⅰ)的配位與抑菌性研究[J].北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2000,(05):20-22.

[6] 葛暢,胡月英,陳文學(xué).香辛料抑菌性及抗氧化性研究現(xiàn)狀[J].熱帶農(nóng)業(yè)工程,2008,(01):14-17.

作者簡(jiǎn)介：江章濤，本科學(xué)歷，吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院。

通訊作者：于加平，吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院，副教授，研究方向：分析化學(xué)和天然產(chǎn)物方面的教學(xué)與研究。

2.2 野生香薷揮發(fā)油的最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC)的測(cè)定結(jié)果

按1.2.4，1.2.5方法測(cè)長(zhǎng)白山野生香薷揮發(fā)油的最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC)，結(jié)果見表3和表4。

由表3和表4可知：野生香薷揮發(fā)油對(duì)酵母的最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC)最大，對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌的最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC)最小，香薷揮發(fā)油對(duì)6種供試菌的最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC)是不同的，其測(cè)定的結(jié)果與抑菌圈直徑大小的測(cè)定結(jié)果是相符的。

野生香薷揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、酵母、青霉、黑曲霉的最小抑菌濃度分別為6.2500、3.1250、3.1250、12.5000、6.2500、6.2500毫克/毫升；最小殺菌濃度分別為12.5000、6.2500、6.2500、25.0000、12.5000、12.5000毫克/毫升?？偟膩碚f，香薷揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌的抑菌作用較強(qiáng)，對(duì)酵母的抑菌作用最弱。

表3 野生香薷揮發(fā)油的MIC（mg/mL）

表4 野生香薷揮發(fā)油的MBC（mg/mL）

3 結(jié)語

為了合理應(yīng)用長(zhǎng)白山區(qū)野生香薷這一寶貴資源，通過水蒸氣蒸餾技術(shù)提取香薷中的揮發(fā)油，并對(duì)其抑菌性進(jìn)行了研究。采用藥敏紙片法和二倍稀釋法，研究揮發(fā)油稀釋液的抑菌效果，觀察到香薷揮發(fā)油有明顯抑制菌斑生長(zhǎng)的作用，能有效抑制菌斑中細(xì)菌或真菌的生長(zhǎng)繁殖。體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，香薷揮發(fā)油對(duì)試驗(yàn)所選的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、酵母、青霉和黑曲霉這6種菌種均有明顯的抑菌效果，對(duì)酵母幾乎沒有抑菌作用。體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果為香薷揮發(fā)油在醫(yī)藥、食品等方面的應(yīng)用提供了依據(jù)。香薷揮發(fā)油的一些藥理作用與其化學(xué)成分有密切的關(guān)系，但作用機(jī)理目前尚不明確，還有待于進(jìn)一步探討。

參考文獻(xiàn)

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[3] 陳根順,李鵬,陳陽.江香薷揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,(05)：61-63.

[4] 羅琴,李星,李洋.益智仁揮發(fā)油的水蒸氣蒸餾法提取工藝優(yōu)化及其體外抑菌活性的研究[J].華西藥學(xué)雜志,2011,26(2):147-149.

[5] 趙玉清,劉寶全,李慧,蔣本國.殼聚糖-Ag(Ⅰ)的配位與抑菌性研究[J].北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2000,(05):20-22.

[6] 葛暢,胡月英,陳文學(xué).香辛料抑菌性及抗氧化性研究現(xiàn)狀[J].熱帶農(nóng)業(yè)工程,2008,(01):14-17.

作者簡(jiǎn)介：江章濤，本科學(xué)歷，吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院。

通訊作者：于加平，吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院，副教授，研究方向：分析化學(xué)和天然產(chǎn)物方面的教學(xué)與研究。

2.2 野生香薷揮發(fā)油的最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC)的測(cè)定結(jié)果

按1.2.4，1.2.5方法測(cè)長(zhǎng)白山野生香薷揮發(fā)油的最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC)，結(jié)果見表3和表4。

由表3和表4可知：野生香薷揮發(fā)油對(duì)酵母的最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC)最大，對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌的最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC)最小，香薷揮發(fā)油對(duì)6種供試菌的最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC)是不同的，其測(cè)定的結(jié)果與抑菌圈直徑大小的測(cè)定結(jié)果是相符的。

野生香薷揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、酵母、青霉、黑曲霉的最小抑菌濃度分別為6.2500、3.1250、3.1250、12.5000、6.2500、6.2500毫克/毫升；最小殺菌濃度分別為12.5000、6.2500、6.2500、25.0000、12.5000、12.5000毫克/毫升?？偟膩碚f，香薷揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌的抑菌作用較強(qiáng)，對(duì)酵母的抑菌作用最弱。

表3 野生香薷揮發(fā)油的MIC（mg/mL）

表4 野生香薷揮發(fā)油的MBC（mg/mL）

3 結(jié)語

為了合理應(yīng)用長(zhǎng)白山區(qū)野生香薷這一寶貴資源，通過水蒸氣蒸餾技術(shù)提取香薷中的揮發(fā)油，并對(duì)其抑菌性進(jìn)行了研究。采用藥敏紙片法和二倍稀釋法，研究揮發(fā)油稀釋液的抑菌效果，觀察到香薷揮發(fā)油有明顯抑制菌斑生長(zhǎng)的作用，能有效抑制菌斑中細(xì)菌或真菌的生長(zhǎng)繁殖。體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，香薷揮發(fā)油對(duì)試驗(yàn)所選的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、酵母、青霉和黑曲霉這6種菌種均有明顯的抑菌效果，對(duì)酵母幾乎沒有抑菌作用。體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果為香薷揮發(fā)油在醫(yī)藥、食品等方面的應(yīng)用提供了依據(jù)。香薷揮發(fā)油的一些藥理作用與其化學(xué)成分有密切的關(guān)系，但作用機(jī)理目前尚不明確，還有待于進(jìn)一步探討。

參考文獻(xiàn)

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[6] 葛暢,胡月英,陳文學(xué).香辛料抑菌性及抗氧化性研究現(xiàn)狀[J].熱帶農(nóng)業(yè)工程,2008,(01):14-17.

作者簡(jiǎn)介：江章濤，本科學(xué)歷，吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院。

通訊作者：于加平，吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院，副教授，研究方向：分析化學(xué)和天然產(chǎn)物方面的教學(xué)與研究。