降膽固醇能力強的耐酸耐膽鹽乳酸菌的篩選及鑒定

溫子輝，李大鵬，張文天，何世鵬，鄭大浩，尚偉豪，雷彥平

（黑龍江八一農墾大學食品學院，大慶 163319）

近年來，隨著人們健康意識的逐步增強，食品、保健品和醫(yī)藥等的安全性越來越受到人們的關注。從上個世紀70年代開始，科學家發(fā)現(xiàn)乳酸菌的食用能起到降人體血液中膽固醇的作用[1]。Grill 等[2]給血清總膽固醇水平偏高的患者服用嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌制劑，8 個月后發(fā)現(xiàn)被測人群血清膽固醇含量均顯著下降。于景華等[3]通過建立益生菌的純培養(yǎng)模型和發(fā)酵模型并將其應用于篩選降膽固醇益生菌的研究中，結果表明：實驗菌株均表現(xiàn)出了不同的脫除能力，并且菌株脫除膽固醇的能力與其自身特性有關。此外，郭東起等[4]通過科學的方法經體外降膽固醇能力實驗、耐酸耐膽鹽實驗、細胞黏附實驗和抑菌實驗分離篩選出了6 株具有降膽固醇功能的乳酸菌，初步確定乳酸GL-A 為潛在的功能性益生菌。居華等[5]從香腸、臘肉、泡菜、酸奶中篩選出6 株降膽固醇能力較高的乳酸菌，研究表明源于發(fā)酵酸奶中的植物乳桿菌P15 對蛋黃和化合物膽固醇的降解率最高，這也充分表明了降膽固醇益生菌菌株的多樣性。具有降膽固醇的乳酸菌在發(fā)酵食品領域具有廣泛的應用前景。實驗進行了降膽固醇乳酸菌的篩選，對其耐酸耐膽鹽能力進行了研究，為實際應用提供參考。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

從發(fā)酵酸菜中分離出的7 株乳酸菌，分別代號M4、M5、M7、M8、M 10、M16、M17。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）MRS 液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，牛肉膏10 g，葡萄糖20 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，碳酸鈣10 g，吐溫80 1 mL，蒸餾水1 000 mL，用鹽酸將pH 調至6.0。121 ℃濕熱滅菌15 min[6]。

（2）MRS 固體培養(yǎng)基：瓊脂15 g，其他營養(yǎng)物質同MRS 液體培養(yǎng)基。

（3）MRS-CHOL 培養(yǎng)基[5]。

1.1.3 主要儀器設備

高壓蒸汽滅菌鍋、離心機、干燥箱、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、轉式恒溫調速搖床恒溫箱、分光光度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 降膽固醇能力強菌株的篩選

分別以1%和5%的接種量將菌株菌懸液接種于MRS-CHOL 培養(yǎng)基[5]中，于恒溫振蕩培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是37 ℃，振蕩速度60～80 r·min-1，培養(yǎng)72 h 后分別測定菌株降解膽固醇的能力。

菌株降解膽固醇能力的測定：將菌株液體培養(yǎng)物和MRS-CHOL 培養(yǎng)基搖勻后吸取0.2 mL 裝于有4.8 mL無水乙醇的離心管中，混勻；10 min 后4 000 r·min-1離心5 min；取上清液2 mL 于試管中，加入2 mL 硫酸鐵銨工作液，搖勻，以2 mL 無水乙醇加入2 mL 硫酸鐵銨工作液為空白，30 min 后于560 nm 下測樣品的吸光度，并計算膽固醇的降解率[7]。

計算方法：膽固醇降解率（%）=（膽固醇總量-上清中膽固醇的量）/膽固醇總量。

1.2.2 耐酸性的能力的測定

挑取斜面菌種于MRS 液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)16～18 h。將菌懸液4 000 r·min-1離心15 min，用無菌生理鹽水洗滌，并將沉淀懸浮于等體積的無菌生理鹽水中。將制備好的細胞懸浮液接入pH 為2 和pH 為3 的磷酸鹽緩沖液中30 ℃培養(yǎng)1 h 和2 h。培養(yǎng)完成后進行10 倍梯度稀釋，取0.1 mL 的稀釋液涂布在MRS 固體培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)2 d，進行細胞計數(shù)[8]。

1.2.3 耐膽鹽的能力的測定

挑取斜面菌種于MRS 液體培養(yǎng)基中，30 ℃在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h。將培養(yǎng)基搖勻，再取10 mL培養(yǎng)液離心收集菌泥，6 000 r·min-1離心15 min，收集菌泥，加入等體積的生理鹽水混合均勻。將細菌懸浮液接入滅菌的含有0%、0.3%、0.5%、1.0%膽鹽的10 mL MRS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，10 倍梯度稀釋后涂布MRS固體培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)2 d，進行細胞計數(shù)[8]。

1.2.4 菌種的鑒定

（1）個體形態(tài)觀察

將菌種細胞制成水浸片，革蘭氏染色后，干燥，鏡檢。

（2）菌落形態(tài)觀察

將菌株培養(yǎng)液稀釋，涂布在MRS 固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)16～18 h，觀察菌落形態(tài)特征。

（3）生理生化實驗

鑒定方法參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[9]對菌種進行生理生化實驗[9]。

2 實驗結果與分析

2.1 降膽固醇能力強的菌株的篩選

由表1 可見，將從發(fā)酵酸菜中篩選的7 株乳酸菌在MRS-CHOL 培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h 后，M16 菌株的膽固醇降解率最大，膽固醇降解率為52.21%。因此選擇M16 菌株作為降膽固醇能力強的菌株。

2.2 菌種耐酸性能力的測定

由表2 可以看出，酸對M16 菌株的細胞活性影響顯著。隨著培養(yǎng)時間的延長，活細胞數(shù)呈下降的趨勢，隨著pH 的降低，活細胞數(shù)也顯著下降。M16 菌株的細胞在pH 2 環(huán)境中30 ℃培養(yǎng)2 h 后活細胞數(shù)仍然可以達到4.5×106CFU·mL-1。Conway 等[10]報道L.acidophilus ADH，L.acidophilus N2 當在pH 2.0 的環(huán)境下1.5 h 后，其活細胞數(shù)下降到10 CFU·mL-1以下。人體胃中的pH 為2～3，因此M16 菌株具有較好的耐酸性，可以耐受人體的胃酸環(huán)境。

2.3 菌種耐膽鹽能力的測定

表1 菌株膽固醇降解率Table 1 Degradation rate of strains cholesterol

表2 M16 在酸性條件下培養(yǎng)的活菌數(shù)量（CFU·mL-1）Table 2 The number of live bacteria in acidity of M16（CFU·mL-1）

表3 M16 在膽鹽條件下培養(yǎng)的活菌數(shù)量（CFU·mL-1）Table 3 The number of live bacteria in bile of M16（CFU·mL-1）

由表3 可以看出，膽鹽對M16 菌株的細胞活性影響顯著。隨著培養(yǎng)時間的延長，活細胞數(shù)呈下降的趨勢，隨著膽鹽濃度的提高，活細胞數(shù)也顯著下降。M16 菌株在1.0%膽鹽的環(huán)境中培養(yǎng)4 h 后活細胞數(shù)仍然可以達到1.0×106。Bhardwaj 等人[11]報道當在0.5%的膽鹽中培養(yǎng)1 h 后E.faecium FH 99 的活細胞數(shù)由108CFU·mL-1下降為104CFU·mL-1。人體胃中的膽鹽含量不超過0.5%，因此M16 菌株具有較強的耐膽鹽的能力。

2.4 菌種的鑒定

2.4.1 形態(tài)觀察

（1）個體形態(tài)特征觀察

圖1 M16 菌株個體形態(tài)（10×100）Fig.1 The individual form of M16

由圖1 可以看出，M16 細胞革蘭氏染色呈陽性，形態(tài)為桿狀。單個或連成成鏈，不運動，不產芽孢，無莢膜，過氧化氫酶實驗陰性，是厭氧、微好氧或兼性好氧的細菌。

（2）菌落形態(tài)特征觀察

由圖2 可見，在MRS 固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)12 h，菌落直徑為0.8～1.4 mm，乳白色，有光澤，不透明，邊緣整齊，扁平，有微微的酸味。

圖2 M16 菌株菌落特征Fig.1 Colony characteristics of M16

2.4.2 生理生化實驗

參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[9]進行生理生化實驗，實驗結果見表4。

表4 M16 菌株生理生化實驗結果Table 4 Results of physiology and biochemistry experiments in bile of M16

由表4 可以看出，M16 菌株的生理生化實驗結果與《乳酸菌鑒定手冊》中乳桿菌屬一致，因此將M16 菌株鑒定該種乳酸菌為乳桿菌屬的乳酸菌。

3 結論

（1）從發(fā)酵酸菜中分離出的7 株乳酸菌中篩選出膽固醇降解率為52.21%的菌株M16。

（2）M16 菌株進M16 具有較強的耐酸耐膽鹽能力。

（3）通過個體形態(tài)和菌落特征觀察及生理生化實驗結果綜合分析，將M16 鑒定為乳桿菌屬的乳酸菌。

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