基于表告依春的板藍(lán)根水提正交試驗(yàn)研究

吳國(guó)軍，武瑞，趙微微，王翠媛，郝丹丹，曲艷鵬

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319）

板藍(lán)根（Radix isatidis）別名靛青根、藍(lán)靛根、靛根，是十字花科植物菘藍(lán)（Isatis irdigotica Fort.）的根，為傳統(tǒng)抗病毒中藥之一。本品味苦性寒，歸心、肝、胃經(jīng)，具有清熱解毒、涼血利咽之功效[1]。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)板藍(lán)根進(jìn)行了深入的研究，并已分離鑒定出包括生物堿、木質(zhì)素、表告依春、神經(jīng)酰胺和黃酮等近百個(gè)化合物[2-6]。

在對(duì)板藍(lán)根提取工藝的研究中，板藍(lán)根的檢測(cè)指標(biāo)始終沒(méi)有明確的規(guī)定，因此檢測(cè)指標(biāo)多種多樣，如孫東東等[7]以單體直鐵線(xiàn)蓮寧B 提取率、總木質(zhì)素及總酚提取率等多指標(biāo)綜合加權(quán)為指標(biāo)，黃曉玲等[8]以總生物堿提取量為指標(biāo)，黃玉蘭等[9]以靛玉紅含量為檢測(cè)指標(biāo)，王盛等[10]以總木脂素、總有機(jī)酸、總生物堿含量作為篩選指標(biāo)，直到2010年版《中國(guó)藥典》首次將表告依春確定為板藍(lán)根檢測(cè)的檢測(cè)指標(biāo)[1]，表告依春是水溶性成分，試驗(yàn)以表告依春為檢測(cè)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，系統(tǒng)研究板藍(lán)根水提工藝，旨在為板藍(lán)根進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 試驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀（型號(hào)：1200 美國(guó)Agilent 公司）；SK8200H 型超聲波清洗機(jī)（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；AL204 型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)藥品

表告依春（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；板藍(lán)根（產(chǎn)地：河北安國(guó)）；乙腈為色普級(jí)，磷酸為優(yōu)級(jí)純，水為超純水。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 表告依春含量的測(cè)定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.03%磷酸水-乙腈（90∶10）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量2 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)（λ）：245 nm，分離樣品與對(duì)照品效果良好，表告依春保留時(shí)間為7 min，標(biāo)準(zhǔn)品分離效果見(jiàn)圖1，供試品分離效果見(jiàn)圖2。

圖1 表告依春標(biāo)準(zhǔn)品分離圖Fig.1 Chromatogram of epigoitrin

圖2 板藍(lán)根供試品分離圖Fig.2 Chromatogram of Radix isatidis

2.1.2 精密度試驗(yàn)

將表告依春標(biāo)準(zhǔn)品配制成100 μg·mL-1的溶液，置于檢測(cè)波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)置6 個(gè)重復(fù)，進(jìn)樣量為2 μL，計(jì)算RSD 值為0.17%，表明精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品，在色譜條件下，分別于0、2、4、6、8 h分別檢測(cè)峰面積，進(jìn)樣量為2 μL，計(jì)算RSD 值為0.27%，表明在0～8 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn)

同一批次的供試樣品3 份，進(jìn)樣量為2 μL，在同一色譜條件下，計(jì)算RSD 為0.06%，表明重復(fù)性良好。

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)品原液的制備

精密稱(chēng)取經(jīng)五氧化二磷干燥至恒重的表告依春對(duì)照品7.5 mg，置25 mL 燒杯中，加入10 mL 流動(dòng)相溶液，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，將溶液轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相溶液定容，即得。

2.1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備

將表告依春標(biāo)準(zhǔn)品原液分別配制成0、50、100、150、200、250、300 μg·mL-1的溶液，分別置于檢測(cè)波長(zhǎng)下，測(cè)定其峰面積，以峰面積作為y 軸，表告依春濃度作為x 軸建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖3，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程y=8.458 7x-47.081，R2=0.993 5。表告依春濃度在0 μg·mL1～300μg·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

圖3 表告依春標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.3 Standard curve of epigoitrin

2.1.7 板藍(lán)根提取液供試品的制備

精密量取制備的板藍(lán)根原藥1 g，置于25 mL 燒杯中，加入10 mL 流動(dòng)相溶液，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 分鐘，將溶液轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相溶液定容，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾即得。

2.1.8 板藍(lán)根提取液中表告依春含量的計(jì)算

取板藍(lán)根供試品2 μL，在檢測(cè)波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)，并將檢測(cè)結(jié)果帶入標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程計(jì)算供試品中表告依春的濃度。

2.2 單因素試驗(yàn)

采用單因素分析法，以表告依春含量為指標(biāo)，討論加水倍數(shù)、侵泡時(shí)間、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)板藍(lán)根提取效果的影響，初步確定主要影響因素。各單因素提取條件如下表1，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4 至圖7。

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，影響板藍(lán)根表告依春提取效果的大小順序?yàn)榧铀稊?shù)＞提取時(shí)間＞提取次數(shù)＞浸泡時(shí)間。故選取對(duì)板藍(lán)根中表告依春提取效果影響明顯的試驗(yàn)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，進(jìn)一步確定最佳提取條件。

2.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定浸泡時(shí)間為60 min，以加水倍數(shù)、提取時(shí)間和提取次數(shù)為影響因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)，具體的正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表2 和表3。以板藍(lán)根中表告依春含量為指標(biāo)，確定板藍(lán)根最佳提取工藝。

圖4 加水倍數(shù)對(duì)表告依春峰面積的影響Fig.4 Effects of solid-liquid ratio to the epigoitrin extraction

表1 板藍(lán)根單因素提取條件表Table 1 Extraction condition of single factor on Radix isatidis

圖5 浸泡時(shí)間對(duì)表告依春峰面積的影響Fig.5 Effects of soaking time effect on the technology for the epigoitrin extraction

圖6 提取時(shí)間對(duì)表告依春峰面積的影響Fig.6 Results of extracting time to the epigoitrin extraction

圖7 提取次數(shù)對(duì)表告依春峰面積的影響Fig.7 Effects of different extraction times to the epigoitrin extraction

表2 板藍(lán)根正交試驗(yàn)考察因素及水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment on Radix isatidis

表3 板藍(lán)根L9（34）正交試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 3 Design and results of orthogonal experiment on Radix isatidis

表4 方差分析表Table 4 The variance analysis

由表3 和表4 可以看出，影響表告依春提取率的因素關(guān)系為A＞B＞C，加水倍數(shù)對(duì)提取率的影響極顯著（P＜0.01），應(yīng)選擇最優(yōu)提取條件，直觀分析最佳提取條件因?yàn)锳3B3C2D1，但提取時(shí)間和提取次數(shù)影響不顯著（P＞0.05），結(jié)合生產(chǎn)成本和提取效率的影響，最佳提取條件為A3B1C1，即加入20 倍量的水，提取60 min，提取1 次。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

稱(chēng)取板藍(lán)根3 份，每份10 g，按照優(yōu)選方案進(jìn)行提取，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。

結(jié)果表明，該提取工藝穩(wěn)定可行。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of the repetitive experiment

3 結(jié)論

單因素試驗(yàn)結(jié)果中隨著加水倍數(shù)的提高，提取次數(shù)的增加，表告依春提取效果下降，其原因可能是加水倍數(shù)和提取次數(shù)的增加可以使提取液體積量增大，進(jìn)而增加了藥液的濃縮時(shí)間，導(dǎo)致表告依春受熱時(shí)間增加，使表告依春可能發(fā)生變性而含量降低。提示表告依春可能具有熱不穩(wěn)定性，這與隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，表告依春含量下降結(jié)果相一致。

綜上所述，試驗(yàn)優(yōu)選了板藍(lán)根中表告依春水提法的最佳方案為最佳提取工藝為加入20 倍量的水，浸泡60 min，提取60 min，提取1 次，該工藝簡(jiǎn)單、可行、重復(fù)性好，為板藍(lán)根制劑的生產(chǎn)提供了參考。

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