色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術測定人體內(nèi)類固醇激素的研究進展

錢 躚，趙 亮，呂 磊，張 海，李悅悅，張國慶 (第二軍醫(yī)大學東方肝膽外科醫(yī)院藥材科，上海 200438)

類固醇激素又稱甾體激素，是內(nèi)分泌細胞分泌的高效能生物化學物質(zhì)。它們在維持生命、調(diào)節(jié)機體物質(zhì)代謝、促進性器官發(fā)育和維持生育等方面起著重要作用。激素主要通過血液傳遞，以很小的劑量在靶細胞上與受體結(jié)合而發(fā)揮作用，具有極高的專屬性。當體內(nèi)類固醇激素水平下降或缺乏時，機體就會產(chǎn)生嚴重的癥候群，甚至危及生命，因此臨床上將測定類固醇激素水平作為很多疾病的診斷參考指標[1，2]。然而，內(nèi)源性類固醇激素在人體內(nèi)的含量很低，并且隨年齡、性別的不同而異，一般在nmol/L和pmol/L數(shù)量級。這對于體內(nèi)類固醇激素的超微量、高靈敏度、精確定量檢測提出了重大挑戰(zhàn)。目前測定類固醇激素的方法主要有生物法[3-7]和化學法[8-15]，生物法包括放射免疫測定(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)等，化學法包括氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS、GC-MS/MS)、液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS/MS)等，其中質(zhì)譜檢測技術是當前的發(fā)展趨勢。筆者分析了以上測定方法的優(yōu)缺點及其發(fā)展應用，重點探究色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術在測定激素方面的研究進展，為其在診斷疾病方面的應用提供參考依據(jù)。

1 類固醇激素的分類及合成通路

人體內(nèi)的類固醇激素按藥理作用可分為腎上腺皮質(zhì)類固醇激素和性激素兩大類。腎上腺皮質(zhì)激素包括鹽皮質(zhì)激素和糖皮質(zhì)激素；性激素主要包括雌激素、雄激素、孕激素。類固醇激素按化學結(jié)構(gòu)可分為雌甾烷(18C原子)、雄甾烷(19C原子)和孕甾烷(21C原子)3大類。

類固醇激素由膽固醇為母體合成，很多具有重要的臨床作用[15，16]。合成過程主要在腎上腺皮質(zhì)、性腺和胎盤細胞的線粒體和平滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上完成，見圖1。首先以膽固醇為前體，通過裂解酶的作用使側(cè)鏈縮短，產(chǎn)生21碳的孕激素。孕激素一方面可以通過羥化酶的作用形成21碳的糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素，另一方面可以去側(cè)鏈衍化為19碳的雄激素，雄激素可以通過A環(huán)的芳香化生成18碳的雌激素。合成過程需要多種羥化甾醇脫氫酶(HSD)和細胞色素P450(CYP)以及其他代謝復合酶的參與。

圖1 類固醇激素的合成通路

2 生物法測定類固醇激素的含量

生物法如放射免疫法(RIA)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)在過去被認為是測定生物樣品中類固醇激素的理想方法。Abraham[7]于1969年發(fā)明RIA用于測定雌二醇(E2),采用的是有機溶劑提取和柱分離技術來消除物質(zhì)間的交叉反應，該方法靈敏有效。后來，RIA得到發(fā)展用于測定更多關鍵的類固醇激素及其代謝物，如雙向的免疫放射分析(IRMA)和免疫化學發(fā)光分析法(ICMA)提高了靈敏度和專屬性， ICMA同時消除了放射的必要性。由于靈敏度很高，很多臨床診斷實驗室均采用生物法測定類固醇激素水平。但是現(xiàn)在的研究發(fā)現(xiàn)上述方法存在一定的缺陷：首先，一次只能分析一種被測物，因此測定一種類固醇激素的多種代謝物就需要多次測定。其次，類固醇激素代謝物在結(jié)構(gòu)上具有很高的相似性。因此，使用免疫測定法很難控制生物基質(zhì)中可能存在的結(jié)構(gòu)相似物的干擾。第三，生物法不能對分析物進行結(jié)構(gòu)確證。最后，并不是所有的目標類固醇代謝物都存在相應的抗血清以得到準確的免疫測定，這一點對于類固醇結(jié)合物的免疫測定尤為明顯。

3 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術測定類固醇激素的應用

近年來，質(zhì)譜技術已發(fā)展成為分析內(nèi)源性代謝物和藥物的通用定量方法，通過與氣相色譜(GC)或高效液相色譜(HPLC)聯(lián)用，可以快速并準確地分離多種化合物，并且能在一定程度上完成自動化分析。色譜-質(zhì)譜檢測技術是當前的發(fā)展趨勢，也是目前最為可靠的激素檢測方法，同時可驗證其他測定方法的準確性，并鑒定未知物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。以下分別介紹有關激素分析的前處理技術、氣相色譜-質(zhì)譜和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術在激素檢測中的應用和發(fā)展。

3.1 前處理技術 由于人體內(nèi)源性激素含量很低，且存在復雜的基質(zhì)干擾。因此，樣品測定前一般要對其進行提取、純化和濃縮，選擇合適的前處理方法對于類固醇激素的準確測定意義重大。目前常用的前處理方法包括液液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)。提取技術取決于樣品類型并且要有特異性，同時需滿足高通量和靈敏度。通常為達到實際的檢測需求，需要單獨或協(xié)同使用不同的前處理方法。

3.1.1 液液萃取技術 LLE基于分析物在水相和有機相中的分配，該方法簡單、快速、有效，通常是從生物基質(zhì)中提取類固醇激素的首選方法。理想的萃取溶劑應能保證在高效提取被測物質(zhì)時盡可能減少對樣品中共存干擾物的提取。目前已報道的提取溶劑包括甲基叔丁基醚(MTBE)、二乙醚、二氯甲烷和一定比例乙酸乙酯與正己烷的混合物等。Rahkonen等[18]全面考察了MTBE、二乙醚、正己烷和2-甲基丁烷對血清樣本中雄激素和孕激素的提取效率，結(jié)果表明，相對于其他溶劑，MTBE提取效率較高，被測7種類固醇激素的回收率均接近100%；二乙醚對于17-羥基孕酮、孕酮和孕烯醇酮的提取效率為MTBE的85%～95%；正己烷對睪酮、17-羥基孕酮的提取效率較低；2-甲基丁烷對孕烯醇酮和孕酮的提取率低于80%。而Rothman等[19]采用二乙醚提取生物樣本中的雌激素(雌酮和雌三醇)，平均提取效率接近100%。LLE的缺點在于操作上的難以自動化。

3.1.2 固相萃取技術 SPE屬于吸附萃取技術，最大的特點是能在分離純化的同時對被測物進行濃縮。用于內(nèi)源類固醇激素純化的SPE柱主要有離子交換柱Strata X、C18柱和混合模式的Oasis HLB柱。Kushnir等[20]采用Strata X柱處理4種類固醇激素(11-脫氧皮質(zhì)醇、17-羥基孕酮、17-羥基孕烯醇酮、孕烯醇酮)，萃取柱先用2 ml甲醇-水活化，上樣后用3 ml水以及3 ml乙腈-水沖洗，最后用2 ml MTBE洗脫，4種激素的絕對回收率均大于89%，定量限為0.05～0.25 ng/ml，但該方法操作煩瑣，耗時長，結(jié)果不穩(wěn)定。Carvalho等[21]采用C18柱代替離子交換柱對人血清中的9種類固醇激素進行處理，實現(xiàn)了3種類型類固醇激素的同時測定，該方法簡單易于操作且耗費低。Mc Whinney等[22]采用Oasis HLB柱分離純化血漿、血漿超濾液、尿液和唾液等多種介質(zhì)中的5種皮質(zhì)醇類類固醇激素，結(jié)果顯示該方法基質(zhì)效應小，各組分的回收率均大于80%，適用于實驗室的痕量分析。

在線固相萃取技術是固相萃取的新發(fā)展，它將化學鍵合相硅膠預柱與HPLC配合，通過切換閥可以實現(xiàn)柱切換HPLC分離分析，達到生物樣品純化、濃集、分離、測定的一體化和自動化。Guo等[15]將這項技術應用于血漿中睪酮、皮質(zhì)醇、孕酮和雄烯二酮的含量測定。結(jié)果表明該方法操作簡單，被測物回收率較高且基質(zhì)效應較小。與離線提取過程相比，在線固相萃取具有相似的精密度和準確度，但能縮短樣品前處理時間并提高靈敏度，同時自動化程度更高。

3.1.3 多種前處理方法結(jié)合 將PP、LLE和SPE結(jié)合使用可以降低樣品的復雜性、基質(zhì)效應并提高靈敏度。Rauh等[23]將PP與在線SPE結(jié)合分析17-羥基孕酮、睪酮和雄烯二酮，采用甲醇沉淀蛋白后，將上清液轉(zhuǎn)移到自動進樣器的96孔板中，提取柱(Oasis HLB)用水-甲醇(95:5V/V)以3 ml/min沖洗1 min后，轉(zhuǎn)換柱切換閥進入分析柱(RP-C18)，乙腈-甲醇(30:70V/V)以1 ml/min流速洗脫，總的分析時間為6 min，該法自動、快速、靈敏，定量限可達0.03～0.06 ng/ml。

3.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術用于激素的檢測 在20世紀70年代，GC-MS開始運用于分析尿液中的類固醇激素及其代謝物，由于內(nèi)源性類固醇激素多含有極性基團，同時分泌物主要以硫酸鹽和葡萄糖酸鹽的形式存在，因此尿液中的類固醇激素在GC-MS進樣前需要水解并衍生化，這一點限制了自動化操作并且增加了提取過程的復雜性。盡管如此，Shackleton等[24]還是開發(fā)了采用GC-MS同時測定尿液中多達40種類固醇激素的方法，雖然具有高通量的特點，但該方法中前處理步驟較為煩瑣且被測物充分分離的時間較長。

串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)可以降低背景干擾，提高單一MS的選擇性從而得到更高的靈敏度，因此廣泛應用于內(nèi)源性激素的分析。Hansen等[25]采用SPE作為前處理方法，測定生物基質(zhì)中的9種重要類固醇激素。該方法可以消除脂類(脂肪酸、磷脂、甘油酯)的干擾，血清樣本體積僅需200 μl。衍生化后采用GC-MS/MS測定，得到雌激素、雄激素、孕激素的定量限分別為：0.08～0.16、0.20～0.36、0.36～0.43 ng/ml。Courant等[26]測定健康兒童血清性激素及其代謝物水平以尋求性別差異對激素水平的影響。該方法準確靈敏，樣品經(jīng)N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺衍生化后，SPE ChromP柱吸附純化，進入GC-MS/MS分析，得到的雄激素定量限為0.07 pmol/L，雌激素為3.7 pmol/L，滿足痕量分析的需求。

衍生化在氣質(zhì)聯(lián)用分析中應用較多，主要目的是提高類固醇激素的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性。常用的衍生化方法包括丹?；?、氧化、烷烴化和硅烷化等，選擇的衍生化反應一般要求簡單、快速、重現(xiàn)性好，且過量的衍生化試劑應易于除去。Courant等[26]的研究表明分別對雌激素和雄激素采用五氟芐基溴(PFBBr)和N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺(MSTFA)硅烷化與對兩種激素同時用MSTFA衍生化相比，能得到更低的檢測限。這表明，雌激素優(yōu)選PFBBr衍生化，而雄激素優(yōu)選MSTFA衍生化。但該方法的缺點在于需要更長的色譜分析時間。

在氣質(zhì)聯(lián)用分析類固醇激素的研究中，通常采用內(nèi)標法克服樣品純化過程中被測激素損失而造成的誤差[27，28]，其中最理想的內(nèi)標物為同位素標記的內(nèi)源性激素。在生物樣品提取一開始就加入已知量的內(nèi)標物，使其與被測激素經(jīng)過相同的分離、純化過程，最后在GC-MS或GC-MS/MS分析中分離，根據(jù)譜圖所得的峰強度比，求出被測激素的含量。在普通的氣相色譜上，由于同位素內(nèi)標與待測的內(nèi)源性激素有相似的保留，在保留時間上很難區(qū)分開，但MS中的選擇離子檢測(SIM)和多反應選擇監(jiān)測(MRM)功能，能根據(jù)其碎片離子的質(zhì)量偏差，選擇合適的監(jiān)測離子，將兩種物質(zhì)明顯區(qū)分并定量。目前，大多數(shù)內(nèi)源性激素的質(zhì)譜定量分析均采用內(nèi)標法定量，可以減少樣品提取、純化時回收率的損失以及儀器的誤差。

3.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術用于激素的檢測 LC-MS/MS用于內(nèi)源性激素檢測通常不需要煩瑣的衍生化步驟，大大減少樣品和試劑的損耗以及前處理的時間，同時避免了衍生化步驟中副反應或反應不完全造成的損失。因此，采用液質(zhì)聯(lián)用測定類固醇激素含量的研究遠多于氣質(zhì)聯(lián)用分析[29]。該方法可以對內(nèi)源性激素進行結(jié)構(gòu)分析，并通過MRM提高選擇性和檢測限。Koal等[30]建立了標準化的HPLC-MS/MS方法測定人血清樣本中的16種類固醇激素，在96孔板中進行SPE前處理，定量限可達0.01～32 ng/ml，回收率為68%～99%，同時將該方法與免疫法比較，發(fā)現(xiàn)其準確度更高。Naessen等[31]建立了用HPLC-MS/MS測定11種類固醇激素水平用于評估70歲老人的心血管疾病發(fā)病率，其中雌激素采用丹酰化衍生物分析，酮類固醇用氧化衍生物分析，該方法靈敏度較高，且定量準確。結(jié)果顯示未患病的受試者體內(nèi)含有較高的雌二醇，而患者體內(nèi)具有較低的孕激素水平以及更高的雌酮/雄烯二酮、雌二醇/睪酮濃度比值。

與HPLC相比，最新發(fā)展的UPLC(超高效液相色譜)運用亞2 μm的小粒徑填料可以增加柱效，同時能耐較高的壓力，使用更高的流速從而得到更短的分離時間。Rossi等[32]測定人血清中的7種類固醇激素用于腎上腺增生的診斷，該方法提取過程簡單，采用UPLC-MS/MS檢測可實現(xiàn)快速分析。采用MTBE提取類固醇激素，質(zhì)譜條件為正離子模式下的電噴霧離子化多反應監(jiān)測。該方法可以在5 min內(nèi)分離定量與腎上腺增生相關的7種類固醇，所得結(jié)果在臨床分析范圍內(nèi)，線性、靈敏度和精密性良好。Kulle等[33]采用UPLC-MS/MS同時測定血漿雄激素(睪酮、雄烯二酮、雙氫睪酮)濃度，并報道了0～18歲兒童在不同年齡、性別、發(fā)育階段的雄激素水平參考范圍。該方法簡單、靈敏、準確并具有高通量的特點，定量限為2.9 ng/ml，在3 min內(nèi)各激素得到充分分離，沒有受到其他類固醇干擾物的影響，所得的參考數(shù)據(jù)可以應用于臨床監(jiān)測和實驗研究。

在液質(zhì)聯(lián)用技術中，質(zhì)譜儀的選擇對于激素的準確定量起著重要作用。目前分析類固醇激素的質(zhì)譜儀有串聯(lián)三重四極桿(QQQ)、線性離子阱-四極桿串聯(lián)(QTrap)、飛行時間質(zhì)譜(TOF)等。其中應用最多的質(zhì)譜儀是QQQ，它具有靈敏度高和重現(xiàn)性好的特點，通常是內(nèi)源性成分含量測定的首選儀器。Koal等[30]采用QTrap檢測人體內(nèi)的多種激素，QTrap將離子阱的高靈敏度和三重四極桿的高選擇性結(jié)合起來。但結(jié)果顯示該方法與傳統(tǒng)的三重四極桿相比并未得到更高的靈敏度。雄激素通過QQQ可以得到低于0.1 pg/ml的定量限，但使用QTrap的最低定量限為10 pg/ml。Rousu等[34]將11種類固醇激素添加到人血漿中，采用SPE前處理后分別進入QQQ和TOF分析比較，TOF的優(yōu)勢在于具有較高的線性范圍和質(zhì)譜分辨率及準確度，采用TOF測定血漿中激素成分的定量限為0.5～20 ng/ml，而QQQ可以達到0.5～5 ng/ml。可見，對于激素分析，三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜比TOF具有更高的檢測靈敏度。

質(zhì)譜選用的離子化方式對于類固醇激素的響應也有著較大影響，目前常用的離子化方式包括電噴霧離子化(ESI)、大氣壓光電電離(APPI)和大氣壓化學電離(APCI)。其中ESI源是使用最為廣泛的離子源，在LC-MS/MS中表現(xiàn)出較高的分析靈敏度。Ceglarek等[35]對離子化方式的選擇進行深入探究，發(fā)現(xiàn)其與質(zhì)譜儀類型、分析物和正負離子模式相關。對于睪酮的測定，傳統(tǒng)的QQQ檢測時采用APPI具有最高的信噪比，而使用QTrap檢測時選擇ESI所得靈敏度更高。該研究還顯示，在正離子模式下測定雌酮和雌二醇，采用APCI源具有更高的信噪比；當采用負離子模式檢測時，APPI響應更高。而對于孕酮的測定，優(yōu)先選擇APPI源。

4 總結(jié)與展望

內(nèi)源性類固醇激素在人體的各種生理活動中起著重要的調(diào)節(jié)作用。因此，對其進行精確的定量檢測一直都是學界關注的焦點之一[36,37]。GC-MS和GC-MS/MS以其高靈敏度、能同時進行定性定量分析等優(yōu)勢，成為分析內(nèi)源性激素的方法之一，但復雜的樣品提取、純化和衍生化過程在很大程度上制約了它的發(fā)展。LC-MS/MS適用于分析極性大、不易揮發(fā)和熱不穩(wěn)定的內(nèi)源性激素，通常無須煩瑣的衍生化步驟，其高選擇性和靈敏度也降低了對樣品前處理的要求。因此，LC-MS/MS在測定不同種類的內(nèi)源性激素中應用更為廣泛。今后，通過色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術對甾體激素進行精確靈敏的定量分析，并結(jié)合其在多種疾病發(fā)展中的變化，可以找到更為精確的診斷指標，為臨床診斷和實驗研究提供參考。

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