MMP3 基因啟動子rs102715950(5A/6A)單核苷酸多態(tài)性與河南人群食管鱗癌易感性的關(guān)系

李 勁, 李可可，姚品芳，陳靜波，陳 真

(1 中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430074；2 湖北省腫瘤醫(yī)院, 武漢 430079)

食管癌(esophagus cancer)是最常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一，我國是世界上食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國家，每年約新診斷25萬食管癌病例，占世界食管癌病例數(shù)1/2，嚴重危害我國人民的健康和生命[1,2].基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)是一類結(jié)構(gòu)相似、高度保守、依賴鋅離子的肽鏈內(nèi)切酶家族，目前已分離出26個成員，分別為MMP1～26.它是腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移過程中最重要的調(diào)控分子之一，現(xiàn)已在多種人類腫瘤中檢測到，且與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移力呈正相關(guān)[3,4]， MMPs家族與腫瘤遺傳易感性研究成為腫瘤的預(yù)防、早期診斷和治療的分子生物學(xué)理論基礎(chǔ)[5].

rs102715950(5A/6A)位于MMP3基因5′端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，為該區(qū)域常見的DNA序列多態(tài)性，即位于轉(zhuǎn)錄起始點上游1612 bp處含有5個或6個腺苷酸(A)的等位基因.近年來已發(fā)現(xiàn)人類MMP3基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)-1612 5A/6A單核苷酸多態(tài)性與急性冠脈綜合癥、高血壓伴頸動脈粥樣硬化、出血性腦卒等疾病的發(fā)病明顯相關(guān)[6,8].

本文利用PCR-RFLP對3類河南人群的MMP3基因進行分型，經(jīng)Logistic 回歸統(tǒng)計分析，探究MMP3基因-1612處DNA序列5A/6A單核苷酸多態(tài)性與河南人群食管癌易感性的關(guān)系.

1 材料與方法

1.1 材料

湖北省鐘祥的河南淅川移民人群的EDTA抗凝靜脈血，由湖北省腫瘤醫(yī)院收集，并經(jīng)胃鏡檢查和病理活檢證實來自非食管癌患者；河南高發(fā)區(qū)(安陽)食管癌患者與當?shù)卣φ杖巳旱腅DTA抗凝靜脈血，由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院癌癥研究室提供；所有標本均于-70℃冰箱保存.

依據(jù)血樣樣本來源和病理診斷分為3類人群，即河南食管癌患者人群，河南正常人群和湖北的河南移民人群.

1.2 方法

1.2.1 血樣樣本DNA的提取

采用蛋白酶K細胞裂解法提取樣本DNA，于-20℃保存.

1.2.2 引物設(shè)計及酶切位點的篩選

利用Primer premier 5.0設(shè)計嵌套PCR引物和酶切位點的選擇.引物設(shè)計：一次PCR引物Out-S: 5′-TAGGCTGAGCAAACTGCCACGC-3′，Out-A: 5′-TCCTGGGACTTGGGAAACAT-3′，擴增長度2120 bp，Tm=65.5℃.二次PCR引物5A/6A-S:5′-TTCTCCATTCCTTTGATGGGGGGAAAGACC-3′， 5A/6A-A: 5′-CCACCACTCTGTTCTCCTTGTCCTCATA-3′，擴增長度105 bp，Tm=57℃.限制性內(nèi)切酶選擇Tth111 I，SNP位點rs102715950 (5A/6A)，酶切溫度65℃，酶切后片段長度79，26 bp.

1.2.3 反應(yīng)體系和循環(huán)

參照taq酶的使用說明書配制體系.一次PCR：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，65.5℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)，72℃延伸5 min.二次PCR：94℃ 預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)，72℃延伸5 min.按照Tth111 I限制性內(nèi)切酶的說明書配制酶切反應(yīng)體系，酶切結(jié)果通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和EB染色進行檢測.

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

將各人群基因組基因型分布進行Hardy-Weinberg平衡檢驗.將各個基因組涉及年齡、性別、基因型等信息導(dǎo)入SPSS 19.0軟件，進行多因素Logistic回歸統(tǒng)計分析.

2 結(jié)果

2.1 PCR-RFLP法對rs102715950 (5A/6A)SNP基因多態(tài)性分析結(jié)果

2.1.1 巢式PCR產(chǎn)物的凝膠電泳檢測

經(jīng)巢式PCR擴增得到105 bp的DNA片段(見圖1)，DNA帶型整齊亮度清晰，無明顯非特異雜帶，表示PCR擴增效果良好，產(chǎn)物特異性高.

圖1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose electrophoretogram of PCR product

2.1.2 DNA酶切分型結(jié)果

PCR擴增的片段經(jīng)Tth111 I限制性內(nèi)切酶酶切，聚丙烯酰胺凝膠電泳(12%)檢測，其結(jié)果見圖2.由圖2可見泳道1為基因組雜合型(DNA半數(shù)酶切)，即5A/6A基因型，酶切片段分別為105，79，26 bp；泳道2是基因組純合型(DNA完全不酶切)，即6A/6A基因，只有105 bp片段；泳道3為基因組純合型(DNA完全酶切)，即5A/5A基因型，酶切片段為79，26 bp.

圖2 Tth111I酶切PCR產(chǎn)物結(jié)果Fig.2 Tth111I enzyme PCR products results

2.2 統(tǒng)計分析結(jié)果

2.2.1 不同人群MMP3基因rs102715950 (5A/6A)位點的基因頻率

不同人群MMP3基因rs102715950 (5A/6A)位點的基因頻率結(jié)果見表1.由表1可見,5A︰6A代表各類人群的5A型和6A 型的比例.5A、5A/6A、6A代表各類人群在相對應(yīng)的基因型的例數(shù)和所占的比率.其中Hardy-Weinberg平衡值均大于0.05，說明取樣具有代表性.

表1 不同人群MMP3基因rs102715950 (5A/6A)SNP位點的基因頻率Tab.1 Genotype frequency of MMP3 rs102715950 (5A/6A) of different groups

2.2.2 多因素Logistic回歸分析

河南3類人群不同基因型的比較結(jié)果見表2.由表2可見，河南食管癌人群和河南高發(fā)移民人群、河南食管癌人群和河南正常人群、河南高發(fā)移民人群和河南正常人群在5A5A︰5A6A、5A5A︰6A6A、5A6A︰6A6A、5A5A︰非5A5A、6A6A︰非6A6A6種基因型比較結(jié)果均為p>0.05.

表2 3種河南人群之間不同基因型的相互比較

注：因河南移民人群和河南正常人群中均無6A6A基因型，故兩個人群在該基因型的對比上無數(shù)據(jù)，用-代表

3 討論

太行山區(qū)，特別是河南人群是我國食管癌的高發(fā)人群，當?shù)囟嗄甑牧餍胁W(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)：食管癌呈明顯的人群和家族聚集現(xiàn)象，暗示該疾病的潛在遺傳性影響和特點，故探究食管癌河南高發(fā)區(qū)人群基因組中食管癌相關(guān)基因的SNP多態(tài)性對人群食管癌遺傳易感的關(guān)聯(lián)性具有重要意義.鑒別與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因變異，為癌癥的預(yù)防、臨床診斷和治療等提供分子標記，對疾病的預(yù)防和診斷具有重要意義，并將改善和提高中國人群食管癌的預(yù)防、篩查、早期診斷和個體化治療的工作水平[9].

MMP3屬于MMPs家族中基質(zhì)溶解素類的一種，MMP3基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)多態(tài)性以等位基因的差異化方式調(diào)節(jié)MMP3的轉(zhuǎn)錄活性[10-12].本研究涉及的MMP3基因5′端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)多態(tài)性于1995年首次由ye等[13]報道.迄今發(fā)現(xiàn)該區(qū)域共有6個多態(tài)性位點.本研究的對象rs102715950 (5A/6A) SNP位于MMP3基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)內(nèi)，為該區(qū)域常見的多態(tài)性位點.馬巖萍等[14]報道5A/6A基因多態(tài)性與漢族原發(fā)性高血壓(essential hyper tension, EH)伴頸動脈粥樣硬化(carotid ather osclerosis, CAS)具有相關(guān)性，6A 等位基因可能增加了EH 患者伴發(fā)CAS 的風(fēng)險.何春燕等[15]發(fā)現(xiàn)MMP3基因5A/6A 多態(tài)性與急性冠脈綜合征危險性有關(guān)，并在冠心病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用.Humphries等[16]證實了MMP3基因5A/6A多態(tài)性和吸煙相互作用與男性冠心病具有相關(guān)性.Krippl等[17]發(fā)現(xiàn)MMP3基因5A/6A多態(tài)性與乳腺癌易感性不相關(guān)，但提高了乳腺癌患者的轉(zhuǎn)移風(fēng)險.

張等[18]針對243例食管鱗癌患者進行基因組MMP3基因的SNP分型，結(jié)果證明rs102715950 (5A/6A)單核苷酸多態(tài)性與食管鱗癌的發(fā)展和淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān) .本文針對河南安陽地區(qū)的食管鱗癌散發(fā)患者、當?shù)亟】等巳骸⒑辩娤榈暮幽箱来ㄒ泼?類人群共381份血液樣本進行基因組MMP3基因的SNP分型，探究MMP3基因rs102715950 (5A/6A)單核苷酸多態(tài)性與河南食管癌易感性的關(guān)系.結(jié)果表明：河南食管癌人群與河南移民人群、河南食管癌人群與河南正常人群、河南移民人群與河南正常人群在5A5A︰5A6A、5A5A︰6A6A、5A6A︰6A6A、5A5A︰非5A5A、6A6A︰非6A6A的6種基因型比對中均無顯著性差異(p>0.05).這提示MMP3基因的rs102715950 (5A/6A)單核苷酸多態(tài)性與河南人群的食管癌易感性不具明顯的相關(guān)性.本研究還需要更多的樣本進行更細致深入的鑒別.如還需要在大樣本量條件下，對該基因上的其他諸多SNPs(基因表達調(diào)控區(qū)和編碼區(qū)的SNPs)的多性和相關(guān)SNPs的人群單倍型不同構(gòu)成方面等，與食管癌遺傳易感性的相關(guān)性進行更多的研究和探討.

參 考 文 獻

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