Tet-off誘導(dǎo)表達(dá)Egr-1 HEK293穩(wěn)定細(xì)胞株的建立和鑒定

彭琬昕，孟凡力，金潔，龔愛華

（1.江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院生物學(xué)系，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.南京師范大學(xué)生命科學(xué)院，江蘇南京210023；3.南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江蘇南京211166）

Tet-off誘導(dǎo)表達(dá)Egr-1 HEK293穩(wěn)定細(xì)胞株的建立和鑒定

彭琬昕1，2，孟凡力2，3，金潔1，龔愛華1

（1.江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院生物學(xué)系，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.南京師范大學(xué)生命科學(xué)院，江蘇南京210023；3.南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江蘇南京211166）

目的：利用大腸埃希菌Tet-off誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)構(gòu)建多西環(huán)素調(diào)控的穩(wěn)定細(xì)胞株。方法：以pEGFPEgr-1質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增含早期生長反應(yīng)蛋白（early growth response-1，Egr-1）完整開放閱讀框的DNA序列，經(jīng)酶切后插入含四環(huán)素反應(yīng)元件（tetracycline responsive element，TRE）序列的表達(dá)載體pTRE2hyg，獲得重組質(zhì)粒pTRE2hyg-Egr-1，將其轉(zhuǎn)染293Tet-off細(xì)胞株，并用G418和多西環(huán)素篩選穩(wěn)定表達(dá)Egr-1的細(xì)胞株。蛋白質(zhì)印跡法檢測多西環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)Egr-1情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖能力。結(jié)果：蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，外源性Egr-1蛋白表達(dá)受細(xì)胞培養(yǎng)液中多西環(huán)素調(diào)控，當(dāng)從細(xì)胞培養(yǎng)液中去除多西環(huán)素后，Egr-1表達(dá)量明顯升高。流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示Egr-1高表達(dá)細(xì)胞的增殖能力明顯高于Egr-1低表達(dá)細(xì)胞。結(jié)論：利用Tet-off體系成功構(gòu)建Egr-1誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞株，細(xì)胞的增殖能力受Egr-1表達(dá)水平的影響。

Tet-off調(diào)控系統(tǒng)；早期生長反應(yīng)蛋白1；穩(wěn)定細(xì)胞株；多西環(huán)素

早期生長反應(yīng)蛋白1（early growth response-1，Egr-1）是具有鋅指結(jié)構(gòu)的核磷酸蛋白，能在多種內(nèi)、外界刺激下迅速表達(dá)，例如促有絲分裂原、生長因子、紫外線照射以及損傷等［1］。目前已證實(shí)Egr-1參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞生長增殖、分化以及凋亡等多種細(xì)胞事件，多種疾病如炎癥及心血管疾病等與其異常表達(dá)相關(guān)［2－5］。因此，研究Egr-1在細(xì)胞中對下游基因的調(diào)控機(jī)制，可以為多種疾病的基因治療提供理論靶點(diǎn)。本研究旨在利用Tet-off誘導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)建立多西環(huán)素調(diào)控Egr-1基因表達(dá)的293穩(wěn)定細(xì)胞株，為研究Egr-1蛋白功能及其下游信號通路的調(diào)控機(jī)制提供一種有價值的細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 材料

Tet-off誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)（Clontech公司）及穩(wěn)定表達(dá)Tet-off質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞系（以下稱293Tet-off細(xì)胞系）由南京大學(xué)李朝軍教授實(shí)驗(yàn)室饋贈。Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶CalⅠ、SalⅠ、CIAP堿性磷酸酶購自TaKaRa公司。DNA片段回收試劑盒、DNA片段PCR純化試劑盒購自Axygen公司，多西環(huán)素和潮霉素B購自Calbiochem公司，一抗Egr-1和β-肌動蛋白購自Santa Cruz公司，羊抗兔HRP二抗購自武漢博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 pTRE2hyg-Egr-1引物設(shè)計和目的基因擴(kuò)增

以已構(gòu)建的pEGFP-Egr-1質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增含Egr-1完整開放閱讀框的DNA序列。上游引物序列為5′-CCATCGAT（ClaⅠ）ATGGCCGCGGCCAAGGCCGAG-3′；下游引物：5′-CGGAATTC（SalⅠ）TATGGTGGGATGGTGAGGCA-3′。反應(yīng)條件：96℃5 min預(yù)變性，94℃45 s，65℃45 s，72℃120 s，循環(huán)30次，最后再72℃延伸7 min。

1.2.2 重組反應(yīng)質(zhì)粒pTRE2hyg-Egr-1的構(gòu)建、克隆、篩選 PCR產(chǎn)物和含四環(huán)素反應(yīng)元件（tetracycline responsive element，TRE）序列的pTRE2hyg載體使用CalⅠ和SalⅠ分步酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳割膠回收，純化DNA。目的基因Egr-1與含相應(yīng)黏性末端的pTRE2hyg連接。

反應(yīng)體系10μL，含10×T4DNA連接酶緩沖液1μL，T4DNA連接酶1 IU，目的基因片段和載體片段按摩爾比3∶1于16℃連接反應(yīng)20 h。連接產(chǎn)物10μL轉(zhuǎn)化入100μL感受態(tài)細(xì)菌DH5α，經(jīng)氨芐西林培養(yǎng)基篩選，重組質(zhì)粒用雙酶切或PCR鑒定后測序分析。

1.2.3 多西環(huán)素抑制EGR-1基因表達(dá)的最佳濃度測定 293Tet-off細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM中，在37℃，含5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將培養(yǎng)的293Tet-off細(xì)胞系接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)60%～70%，按Lipofectamine 2000說明書步驟轉(zhuǎn)染pTRE2hyg-Egr-1重組質(zhì)粒入細(xì)胞，孵育6 h后去除含脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)基，于37°C、5%CO2培養(yǎng)24 h后進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

按照0，0.5，1，2，4，10，100μg／mL設(shè)定多西環(huán)素的質(zhì)量濃度梯度，分別處理轉(zhuǎn)染了pTRE2hyg-Egr-1質(zhì)粒24 h后的293Tet-off細(xì)胞株，同時將未轉(zhuǎn)染pTRE2hyg-Egr-1質(zhì)粒的293Tet-off細(xì)胞作為陰性對照。藥物處理48 h之后，RAPI裂解細(xì)胞，提取總蛋白。每孔蛋白上樣量30μg，蛋白質(zhì)印跡法檢測Egr-1蛋白的表達(dá)情況，選擇多西環(huán)素抑制Egr-1表達(dá)的最佳濃度。

1.2.4 穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選 將293Tet-off細(xì)胞接種至60 mm培養(yǎng)皿中，至密度為70%時轉(zhuǎn)染pTRE2hyg-Egr-1質(zhì)粒。消化細(xì)胞接種至2個10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，用含200μg／mL G418、10%胎牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后，添加潮霉素B至終質(zhì)量濃度為100μg／mL，每兩天換一次液，得到的穩(wěn)定細(xì)胞株命名為293Tet-off-Egr-1。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及酶切鑒定

人Egr-1全長cDNA以正確的讀碼框插入表達(dá)載體pTRE2hyg中，獲得重組質(zhì)粒pTRE2hyg-Egr-1，質(zhì)粒經(jīng)ClaⅠ、SalⅠ雙酶切得到約1 600 bp的片段（圖1），同預(yù)期的結(jié)果相一致。挑取單個菌落送上海生工生物公司進(jìn)行序列測序，結(jié)果完全正確。

圖1 重組表達(dá)載體pTRE2hyg-Egr-1酶切鑒定

2.2 多西環(huán)素負(fù)調(diào)控Egr-1蛋白表達(dá)的測定

將不同質(zhì)量濃度多西環(huán)素（0、0.5、1、2、4、10、100μg／mL）處理的293Tet-off-Egr-1細(xì)胞以及293Tet-off對照組細(xì)胞裂解液加入6×上樣緩沖液，10%SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF上，檢測Egr-1蛋白表達(dá)，以β-肌動蛋白作為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖2），在80 000左右位置檢測到Egr-1蛋白，培養(yǎng)液中未加多西環(huán)素時（0μg／mL），293Tet-off-Egr-1細(xì)胞能有效表達(dá)外源性Egr-1蛋白；隨著濃度的加大，多西環(huán)素對Egr-1表達(dá)的抑制作用逐漸增強(qiáng)。當(dāng)多西環(huán)素的濃度達(dá)到10μg／mL時，與未加多西環(huán)素處理組相比，Egr-1水平明顯降低。

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測293Tet-off-Egr-1細(xì)胞中Egr-1蛋白的表達(dá)

2.3 Egr-1對細(xì)胞增殖能力的影響

利用我們建立的293Tet-off-Egr-1細(xì)胞模型檢測Egr-1不同表達(dá)量情況下細(xì)胞周期的變化情況。結(jié)果顯示，Egr-1高表達(dá)的293Tet-off-Egr-1細(xì)胞（0、1μg／mL多西環(huán)素處理組）S期細(xì)胞所占的比例明顯高于加入了20μg／mL多西環(huán)素的細(xì)胞組（圖3）。

圖3 不同濃度多西環(huán)素處理后細(xì)胞周期的變化

3 討論

Tet-off誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)是20世紀(jì)90年代以來Gossen等［6－8］利用大腸埃希菌轉(zhuǎn)座子Tn10四環(huán)素抗性操縱子創(chuàng)建的一種高效、嚴(yán)密并特異地控制外源基因表達(dá)的體系。通過加入四環(huán)素或其衍生物多西環(huán)素能抑制目的基因的表達(dá)，而在去除培養(yǎng)基中的四環(huán)霉素或多西環(huán)素后目的基因的表達(dá)被激活［9］。隨著細(xì)胞培養(yǎng)基中四環(huán)素或多西環(huán)素減少，外源基因表達(dá)逐漸增加，且表達(dá)按照一種劑量依賴方式受四環(huán)素或者多西環(huán)素精準(zhǔn)調(diào)控［10］。Tet-off系統(tǒng)主要包括2個部分，即調(diào)節(jié)質(zhì)粒和反應(yīng)質(zhì)粒。調(diào)節(jié)質(zhì)粒可以表達(dá)一種融合蛋白，稱為四環(huán)素反應(yīng)轉(zhuǎn)錄活化因子（tTA）；反應(yīng)質(zhì)粒含有四環(huán)素反應(yīng)元件［11］。本實(shí)驗(yàn)中，我們將Egr-1基因插入pTRE載體中反應(yīng)原件TRE的下游，并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染含有pTet-off基因的293穩(wěn)定細(xì)胞株，得到受四環(huán)素及其衍生物多西環(huán)素調(diào)控Egr-1蛋白表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株293Tet-off-Egr-1。

Egr-1又稱NFGI-A、Zif268、Krox24和TIS8等，能被一系列生長因子、細(xì)胞因子和損傷刺激迅速而瞬時地誘導(dǎo)表達(dá)［12－13］。Egr-1參與多種細(xì)胞進(jìn)程，其中包括血管發(fā)生、腫瘤發(fā)生、缺血應(yīng)激、損傷愈合和一些血管疾病［14－15］。Egr-1在體內(nèi)正常組織和細(xì)胞中表達(dá)極低，甚至不表達(dá)；而在生長活躍器官或組織的細(xì)胞中表達(dá)明顯增多。已有文獻(xiàn)報道，Egr-1通過直接或間接地參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化等過程，在腫瘤形成和心血管、肺臟、腎臟等系統(tǒng)的疾病中發(fā)揮重要作用［16－17］。

本實(shí)驗(yàn)中我們成功構(gòu)建了Tet-off基因表達(dá)系統(tǒng)反應(yīng)質(zhì)粒pTRE2hyg-Egr-1。初步結(jié)果顯示，反應(yīng)質(zhì)粒pTRE2hyg-Egr-1轉(zhuǎn)染至293Tet-off細(xì)胞后，在多西環(huán)素的存在下，Egr-1蛋白表達(dá)水平隨多西環(huán)素質(zhì)量濃度升高而下調(diào)。與未加多西環(huán)素處理的對照組相比，實(shí)驗(yàn)組Egr-1表達(dá)量明顯下降。流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，在不同濃度多西環(huán)素存在情況下，隨著Egr-1表達(dá)量的不同，293Tet-off細(xì)胞的周期發(fā)生明顯改變，證明該細(xì)胞株可以作為研究Egr-1對細(xì)胞行為調(diào)控作用的實(shí)驗(yàn)工具。

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Establishment and detection of a Tet-off stable cell line expressing Egr-1 protein regulated by doxycycline

PENGWan-xin1，2，MENG Fan-li2，3，JIN Jie1，GONG Ai-hua1
（1.Department of Biology，School of Medical Science and Laboratory Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013；2.School of life science，Nanjing Normal University，Nanjing Jiangsu 210023；3.School of Basic Medical Sciences，Nanjing Medical University，Nanjing Jiangsu 211166，China）

Objective：To construct the responsive plasmid of pTRE2hyg-Egr-1 Tet-off gene expression system and examine its expression.M ethods：PCR was performed to obtain the cDNA of early growth response-1（Egr-1）which was inserted into the responsive plasmid PTRE2hyg.DNA sequencing was performed after the recombinant of responsive plasmid pTRE2hyg-Egr-1 was identified by sequencing.This recombinant vector was transfected into 293Tet-offcells by means of liposome and its expression was examined by Western blotting under the control of deoxycycline.Results：The responsive plasmid pTRE2hyg-Egr-1 verified by sequencing，was capable of expression in 293Tet-offcould be controlled by deoxycycline concentration.Conclusion：The responsive plasmid pTRE2hyg-Egr-1 of Tet-off expression system was constructed successfully，and it can express under the regulation of deoxycycline in the 293Tet-offcells.

Tet-off inducible gene expression system；early growth response-1；stable cell line；doxycycline

R329.28

A

1671－7783（2014）02－0118－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y140046

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31100964）

彭琬昕（1982—），女，安徽合肥人，講師，主要從事腫瘤細(xì)胞生物學(xué)研究。

2014－03－04 ［編輯］陳海林