不同電子受體除磷污泥相似性與菌群結(jié)構(gòu)研究

呂小梅 ,李 繼 ,2,3*,李朝林 ,劉洞陽 ,邵明非 ,2,3,夏 雪 (.哈爾濱工業(yè)大學(xué)深圳研究生院,廣東 深圳 58055；2.深圳水資源利用與環(huán)境污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 深圳 58055；3.深圳市城市廢棄物能源再生公共技術(shù)服務(wù)平臺,廣東 深圳 58055)

強(qiáng)化生物除磷(EBPR)被認(rèn)為是最經(jīng)濟(jì)有效且環(huán)境友好的生物除磷技術(shù).在該工藝中,通過交替的厭氧-好氧環(huán)境,除磷菌(PAO, phosphorus accumulating organisms)能夠得到富集并發(fā)揮除磷效能.除了厭氧-好氧條件外,厭氧-缺氧條件下磷同樣能夠得到去除[1-3].人們將這類在厭氧-缺氧條件下能夠除磷的微生物稱之為反硝化除磷菌(DPAO,denitrifying phosphorus accumulating organisms),因其能夠?qū)崿F(xiàn)同步脫氮除磷,因而對低碳氮污水的處理具有重要的意義.

目前對于反硝化除磷的研究主要集中在以硝態(tài)氮為電子受體的反硝化除磷的研究,結(jié)果表明,硝態(tài)氮是合適的反硝化除磷污泥電子受體,且有利于節(jié)約曝氣,降低除磷脫氮對碳源的需求[4-5],節(jié)約運(yùn)行成本.因而,研究人員致力于開發(fā)反硝化除磷工藝或在原有除磷工藝基礎(chǔ)上最大化實(shí)現(xiàn)反硝化除磷[6-7,3].另一方面,作為反硝化過程的中間產(chǎn)物,亞硝氮同樣可以作為反硝化除磷污泥的電子受體[8-11].不同形式的基于亞硝氮反硝化除磷工藝均具有良好的脫氮除磷效果,亞硝氮為電子受體的反硝化除磷工藝的研究對強(qiáng)化生物除磷技術(shù)的革新具有重要意義.

盡管反硝化除磷得到了廣泛的研究,然而,由于環(huán)境中絕大部分微生物是不可培養(yǎng)的,而采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的研究也主要是針對厭氧-好氧環(huán)境中的好氧除磷污泥.利用不同電子受體吸磷的除磷菌是否屬于同一類細(xì)菌,目前仍然存在較大爭議.針對除磷菌分類,目前研究主要是通過宏觀表現(xiàn)出來的吸磷特性進(jìn)行定性[12-14],不能從本質(zhì)上揭示原因.為此,本研究采用基于高通量測序的分子生物學(xué)技術(shù),研究采用不同電子受體(硝酸鹽,亞硝酸鹽,氧氣)除磷污泥的相似性與菌群結(jié)構(gòu),為除磷污泥的分類與研究提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)裝置

采用3個平行的SBR反應(yīng)器(圖1),分別以硝酸鹽(RN03),亞硝酸鹽(RN02),氧氣(R02)為電子受體培養(yǎng)不同除磷污泥.RN03與 RN02采用厭氧-缺氧方式運(yùn)行,R02采用厭氧-好氧方式運(yùn)行.SBR反應(yīng)器有效體積為6.5L,每天運(yùn)行3個周期(8h/周期),包括:進(jìn)水(0.25h),厭氧(2.5h),缺氧或好氧(4.0h),沉淀(1.0h),排水(0.25h).對于厭氧-缺氧反應(yīng)器(RN03與 RN02),厭氧釋磷后,采用蠕動泵在缺氧段的前 1.0h連續(xù)投加硝酸鹽或亞硝酸鹽進(jìn)行反硝化吸磷.對于厭氧-好氧反應(yīng)器(R02),好氧段采用曝氣泵進(jìn)行曝氣(流量為 0.3m3/h).為保證污泥充分混合,在厭氧與缺氧(或好氧)階段,采用攪拌器進(jìn)行攪拌(轉(zhuǎn)速為 40r/min).進(jìn)水、攪拌、曝氣、沉淀、排水等操作均采用時間控制器進(jìn)行程序切換.厭氧初,將泥水混合液pH值調(diào)節(jié)至7.0左右,其他階段不再調(diào)節(jié),出水pH值一般為7.6～7.8.

圖1 SBR裝置示意Fig.1 SBR equipment

每個運(yùn)行周期結(jié)束后,從反應(yīng)器排出 4L上清液,并補(bǔ)充等量的人工配水,因而反應(yīng)器水力停留時間(HRT, hydraulic retention time)為13h.RN03,RN02,R023個反應(yīng)器污泥停留時間(SRT, sludge retention time)控制在15～20d.反應(yīng)器在室溫條件下運(yùn)行(平均 14.4～27.7℃),運(yùn)行過程中連續(xù)取樣監(jiān)測反應(yīng)器運(yùn)行效能.

1.2 接種污泥與進(jìn)水水質(zhì)

SBR反應(yīng)器的接種污泥取自深圳市羅芳污水處理廠(A2/O 工藝)二沉池回流污泥.接種污泥的 SVI(sludge volume index)為105mL/g,以硝酸鹽,亞硝酸鹽,氧氣為電子受體時吸磷量分別為0.80, 0.38, 1.3mgP/gVSS.

進(jìn)水采用人工配水,每2天配水1次,以保證配水水質(zhì)不會發(fā)生明顯變化.每 1L配水中包括:200mg CH3COONa, 14mg NH4Cl, 20mg NaH2PO4與0.3mL微量元素溶液.每1L微量元素包 括 :10g EDTA, 0.12g ZnSO4·7H2O, 0.12g MnSO4·7H2O, 0.03g CuSO4·5H2O, 1.0g FeCl3,0.06g (NH4)2Mo4O13·2H2O, 0.15g CoCl2·6H2O,0.15g H3BO3與0.18g KI.另外,按1:10的體積比例向配水中補(bǔ)加經(jīng)過初級沉淀后的生活污水(深圳大學(xué)城校區(qū)內(nèi)生活污水,其水質(zhì)見文獻(xiàn)[15]).配水中,COD約150mg/L, NH4+-N約5.0mg/L, TP約6.0mg/L.

1.3 水質(zhì)分析方法

1.3.1 常規(guī)指標(biāo)分析方法 COD, TP, MLSS采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法測定.COD測定采用重鉻酸鉀滴定法, TP測定采用鉬酸鹽分光光度法, MLSS測定采用重量法.NH4+-N, NO3--N與NO2--N濃度測定采用 Cleverchem200自動化水質(zhì)分析儀(DeChem-Tech.Gmbh, Germany).

1.3.2 DNA提取,PCR擴(kuò)增與高通量測序 污泥樣品包括接種污泥(Seed),接種運(yùn)行第100d時3個SBR中污泥.采用FastDNA?土壤試劑盒(MP Biomedicals, Illkirch, France)進(jìn)行細(xì)菌組DNA提取.16S rRNA基因V6區(qū)序列采用引物對967F(CAACGCGAAGAACCTTACC)與1046R (CGACAGCCATGCANCACCT)進(jìn)行擴(kuò)增[16].30uL PCR反應(yīng)體系包括: 0.75uL的 MightyAmp?DNA 聚合酶(TaKaRa,大連), 15μL 的 2×Buffer,1.5μL 的前后引物,以及 20～50ng 細(xì)菌組 DNA,最后采用 ddH2O補(bǔ)足至 30uL.PCR擴(kuò)增采用i-Cycler (BioRad, USA),擴(kuò)增條件為: 98℃首次變性2min,然后是28個循環(huán)(98℃ 20s, 55℃ 20s,68℃ 1min),最后在 68℃延伸 5min.為減少 PCR擴(kuò)增前期的潛在錯誤,每個DNA樣品同步進(jìn)行3個平行擴(kuò)增,最后再進(jìn)行混合與后續(xù)分析.擴(kuò)增后采用 2.0%的瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證.最后,PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物采用純化試劑盒(天根,北京)進(jìn)行純化,并采用光度法(NanoDrop-1000)測定產(chǎn)物濃度.為滿足測序時樣品混合的需要,前后引物分別增加相同的標(biāo)簽(tag)引物.根據(jù)不同樣品的濃度進(jìn)行取樣混合,保證最后混合樣中各樣品核酸濃度相同.最后采用 Illumina-HiSeq 2000(深圳華大基因科技有限公司)高通量測序技術(shù)進(jìn)行測序.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同反應(yīng)器運(yùn)行效能比較

經(jīng)過39, 54, 27d的連續(xù)運(yùn)行, RN03, RN02與R023個反應(yīng)器除磷效果分別達(dá)到穩(wěn)定,如圖 2所示.

圖2 不同電子受體除磷污泥運(yùn)行效能Fig.2 Operation performance of phosphorus removal sludge with different electron acceptors

從圖2可以看出,相比于好氧除磷污泥,反硝化除磷污泥馴化周期相對較長,尤其是以亞硝酸鹽為電子受體的反硝化除磷污泥,需要相對較長的適應(yīng)周期,可能是由于馴化初期亞硝酸鹽的抑制作用[17].3個反應(yīng)器除磷效果穩(wěn)定后連續(xù)126d的運(yùn)行結(jié)果表明,出水 TP濃度平均為 0.85,1.17,0.65mg/L,相應(yīng) TP去除率分別為 82.7%,73.5%,86.7%.可見,以硝酸鹽為電子受體除磷污泥具有以氧氣為電子受體除磷污泥類似的除磷去除率,這與Kapagiannidis等人[18]的研究結(jié)果一致.而以亞硝酸鹽為電子受體除磷污泥的除磷效率相對較差.

2.2 不同電子受體除磷污泥菌群相似性研究

不同電子受體除磷污泥的菌群相似性采用聚類分析[19]進(jìn)行評價,圖3為基于 3% cutoff-OTUs數(shù)目的聚類結(jié)果.

圖3 基于3% cutoff OTUs級別的Bray-Curtis距離聚類Fig.3 Cluster analysis based on Bray-Curtis distances of 3% cutoff OTUs level.

從圖3可以看出,來自RN03與RN02的反硝化除磷污泥聚為一類,表明以硝酸鹽,亞硝酸鹽為電子受體的反硝化除磷污泥具有更為相似的菌群結(jié)構(gòu),而與好氧除磷污泥菌群結(jié)構(gòu)有較大差異.可見,厭氧-缺氧與厭氧-好氧條件分別為反硝化除磷污泥與好氧除磷污泥提供了不同的生長環(huán)境.

Candidatus Accumulibacter是目前普遍公認(rèn)的除磷微生物[20-22].Martin等[23]通過全基因組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn),Candidatus Accumulibacter基因中無硝態(tài)氮還原酶基因,而檢測到亞硝氮還原至氮?dú)獾拿富?進(jìn)而證實(shí)了同步脫氮除磷系統(tǒng)中硝態(tài)氮的還原是由Candidatus Accumulibacter之外的微生物協(xié)助完成,如Dechloromonas相關(guān)微生物[22],進(jìn)而為缺氧條件下反硝化除磷提供電子受體亞硝氮.因而,可以推測以硝酸鹽或亞硝酸鹽為電子受體的反硝化除磷菌屬于同一類微生物.

2.3 不同電子受體除磷污泥的主導(dǎo)菌群研究

不同電子受體除磷污泥中主導(dǎo) OTUs(序列比例＞1.0%)及其在 NCBI基因庫中的親緣微生物的種系發(fā)育關(guān)系如圖4所示.接種污泥,硝酸鹽,亞硝酸鹽,氧氣分別為電子受體除磷污泥的主導(dǎo)OTUs序列比例分別為 41.4%,52.4%,51.5%與69.0%.從圖 4中可以看出,不同樣品表現(xiàn)出不同的OTUs分布特點(diǎn),而硝酸鹽,亞硝酸鹽為電子受體除磷污泥具有更多近似的分布,這一結(jié)果同樣反映了二者近似的菌群結(jié)構(gòu).

圖4中數(shù)據(jù)為不同污泥的主導(dǎo)OTUs序列比例.硝酸鹽,亞硝酸鹽除磷污泥的主導(dǎo)OTUs比例的平均值如圖4中左側(cè)圈所示(N*),右側(cè)圈(O)為好氧除磷污泥中主導(dǎo) OTUs比例.圈尺寸由小到大分別表示序列比例為:＜1.0%,1.0～2.0%,2.0～3.0%,3.0～4.0%,＞4.0%.基于主導(dǎo) OTUs 的分布特點(diǎn),圖4中種系發(fā)育樹可以分為5個簇.第I簇為與Candidatus Accumulibacter或Rhodocyclus purpureus[24]較為近似,主要為除磷相關(guān)微生物.且第 I簇中好氧除磷污泥比例高于反硝化除磷污泥,進(jìn)而可能導(dǎo)致了前述的除磷污泥效能差異.另外,硝酸鹽與亞硝酸鹽污泥在該簇中 OTUs比例非常近似,再次表明了利用硝酸鹽或亞硝酸鹽的反硝化除磷污泥可能屬于同一類污泥.第II簇為Zoogloea caeni與Thauera aromatic相關(guān)微生物,他們是形成污泥絮體的重要微生物,常報(bào)道于活性污泥工藝系統(tǒng).第 III簇與發(fā)揮硝化作用的Nitrosococcus halophilus近似.該簇中,好氧除磷污泥與種泥具有近似的比例,且遠(yuǎn)高于反硝化除磷污泥中比例,這主要是由于厭氧-缺氧條件下氧氣受限而抑制了硝化菌的生長繁殖.第IV簇包括了污水處理系統(tǒng)幾類常見的微生物,如Desulfonauticus autotrophicus,Halanaerobaculum tunisiense,等.另外,第 V 簇為與 Flavobacterium cheniae相關(guān)微生物.Flavobacterium cheniae是一類病原菌微生物[25],以亞硝酸鹽為電子受體反硝化除磷污泥中的比例遠(yuǎn)高于其他污泥,這表明亞硝酸鹽反硝化除磷污泥對 Flavobacterium cheniae較強(qiáng)的耐受能力.可見,亞硝氮為電子受體除磷時潛在一定的公共衛(wèi)生安全隱患.

圖4 四個污泥樣品中主導(dǎo)OTUs(＞1.0%)及其NCBI數(shù)據(jù)庫中親緣微生物的種系發(fā)育關(guān)系Fig.4 The phylogenetic relationship between the top OTUs (＞1.0%) of the four samples and their close relativesretrieved from NCBI Genbank

2.4 聚磷菌與聚糖菌分析

圖5 不同樣品中聚磷菌與聚糖菌序列比例Fig.5 Proportions of phosphorus accumulating bacteria and glycogen accumulating bacteria in different samples

不同反應(yīng)器污泥中聚磷菌的分析,主要基于與已鑒定聚磷菌的序列進(jìn)行比對.Candidatus Accumulibacter是目前普遍公認(rèn)的聚磷菌[20-22].通過廣泛收集基因庫中全流程污水處理廠與實(shí)驗(yàn)室反應(yīng)器中除磷菌序列以及種系分析,Kim等[22]將Candidatus Accumulibacter分為4個主要簇,基于 Kim 的序列分析,通過本地 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool),得到不同污泥樣品中聚磷菌比例[圖 5(a)].在 97%的序列相似度條件下,種泥,RNO3,RNO2與 RO2中分別有0.716%,1.78%,2.53%,4.80%的序列可以歸于Accumulibacter-like微生物[26-27].這表明,通過厭氧-缺氧或厭氧-好氧馴化后聚磷菌明顯得到了富集,且厭氧-好氧條件下聚磷菌比例明顯高于厭氧-缺氧條件.盡管如此,以硝酸鹽為電子受體除磷污泥與以氧氣為電子受體除磷污泥仍然表現(xiàn)出相近的 TP去除率[18].另一方面,Candidatus Accumulibacter具有不同形態(tài)與表現(xiàn)型多樣性[22,28],厭氧-缺氧條件下有可能存在有別于厭氧-好氧條件下尚未得到鑒定的除磷菌,進(jìn)而表現(xiàn)出厭氧-缺氧條件下較低的除磷菌比例.因而,需要對更多潛在的除磷菌進(jìn)行鑒定與分析.

采用了類似的方法對不同電子受體除磷污泥中聚磷菌的競爭者[29-30]聚糖菌(GAO)進(jìn)行了分析[圖5(b)],在97%的序列相似度條件下,種泥,RNO3,RNO2與RO2中分別有0.368%,1.44%, 1.32%,30.9%的序列可以歸于GAO-like序列.比較而言,厭氧-好氧條件有利于富集聚磷菌,厭氧-缺氧條件更有利于抑制聚糖菌的大量繁殖.

3 結(jié)論

3.1 以硝酸鹽,亞硝酸鹽,氧氣為電子受體除磷污泥對 TP平均去除率分別為84.8%,78.7%,87.4%,出水TP濃度分別為0.758,0.931,0.632mg/L.

3.2 以硝酸鹽,亞硝酸鹽為電子受體的反硝化除磷污泥具有相似的菌群結(jié)構(gòu),與好氧除磷污泥菌群結(jié)構(gòu)差異較大.

3.3 不同污泥樣品具有不同的主導(dǎo)OTUs分布,亞硝氮為電子受體除磷時潛在一定的公共衛(wèi)生安全隱患.

3.4 在 97%的序列相似度條件下,種泥,RNO3,RNO2與 RO2中聚磷菌與聚糖菌序列比例分別為0.716%, 1.78%, 2.53%, 4.80%與0.368%, 1.44%,1.32%, 30.9%.

[1]Lacko N, Drysdale G D, Bux F.Anoxic phosphorus removal by denitrifying heterotrophic bacteria [J].Water Science and Technology, 2003,47(11):17–22.

[2]Tsuneda S, Ohno T, Soejima K, et al.Simultaneous nitrogen and phosphorus removal using denitrifying phosphate-accumulating organisms in a sequencing batch reactor [J].Biochemical Engineering Journal, 2006,27(3):191–196.

[3]張玉秀,張偉偉,薛 濤,等.亞硝酸型反硝化除磷污泥馴化方式的比較 [J].中國環(huán)境科學(xué), 2009,29(5):493-496.

[4]Hu J Y, Ong S L, Ng W J, et al.A new method for characterizing denitrifying phosphorus removal bacteria by using three different types of electron acceptors [J].Water Research, 2003,37(14):3463-3467.

[5]Shoji T, Satoh H, Mino T.Quantitative estimation of the role of denitrifying phosphate accumulating organisms in nutrient removal [J].Water Science and Technology, 2003,47(11):23–29.

[6]Guerrero J, Taya C, Guisasol A, Baeza J A.Understanding the detrimental effect of nitrate presence on EBPR systems: effect of the plant conf i guration [J].Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 2012,87(10):1508–1511.

[7]曾 薇,李博曉,王向東,等.MUCT短程硝化和反硝化除磷系統(tǒng)中 Candidatus Accumulibacter的代謝活性和菌群結(jié)構(gòu) [J].中國環(huán)境科學(xué), 2013,33(7):1298-1308.

[8]蔣軼鋒,朱潤曄,鄭建軍,等.亞硝酸鹽為電子受體的反硝化除磷工藝特征 [J].中國環(huán)境科學(xué), 2008,28(12):1094–1099.

[9]王愛杰,吳麗紅,任南琪,等.亞硝酸鹽為電子受體反硝化除磷工藝的可行性 [J].中國環(huán)境科學(xué), 2005,25(5):515–518.

[10]Marcelino M, Wallaert D, Guisasola A, et al.A two-sludge system for simultaneous biological C, N and P removal via the nitrite pathway [J].Water science and technology, 2011,64(5):1142–1147.

[11]Ma B, Wang S Y, Zhu G B, et al.Denitrification and phosphorus uptake by DPAOs using nitrite as an electron acceptor by step-feed strategies [J].Frontiers of Environmental Science and Engineering, 2013,7(2):267–272.

[12]李勇智,彭永臻,王淑瀅,等.強(qiáng)化生物除磷體系中的反硝化除磷[J].中國環(huán)境科學(xué), 2003,23(5):543–546.

[13]Zeng R J, Saunders A M, Yuan Z G, et al.Identification and comparison of aerobic and denitrifying polyphosphateaccumulating organisms [J].Biotechnology and Bioengineering,2003,83(2):140–148.

[14]Freitas F, Temudo M, Reis M A M.Microbial population response to changes of the operating conditions in a dynamic nutrient-removal sequencing batch reactor [J].Bioprocess and Biosystems Engineering, 2005,28(3):199–209.

[15]李 繼,呂小梅,董文藝,等.A2N/BAF組合工藝深度除磷脫氮研究 [J].哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2012,44(2):80-84.

[16]Turnbaugh P J, Hamady M, Yatsunenko T, et al.A core gut microbiome in obese and lean twins [J].Nature, 2009,457(7228):480–487.

[17]劉建廣,付昆明,楊義飛,等.不同電子受體對反硝化除磷菌缺氧吸磷的影響 [J].環(huán)境科學(xué), 2007,28(7):1472–1476.

[18]Kapagiannidis A G, Zafiriadis I, Aivasidis A.Comparison between UCT type and DPAO biomass phosphorus removal efficiency under aerobic and anoxic conditions [J].Water Science and Technology, 2009,60(10):2695–2703.

[19]Zhang T, Shao M F, Ye L.454Pyrosequencing reveals bacterial diversity of activated sludge from 14sewage treatment plants [J].ISME Journal, 2011,6(6):1137–1147.

[20]Crocetti G R, Hugenholtz P, Bond P L, et al.Identification of polyphosphate-accumulating organisms and design of 16S rRNA-directed probes for their detection and quantitation [J].Applied and Environmental Microbiology, 2000,66(3):1175–1182.

[21]Kong Y, Nielsen J L, Nielsen P H.Microautoradiographic study of Rhodocyclus-related polyphosphate-accumulating bacteria in full-scale enhanced biological phosphorus removal plants [J].Applied and Environmental Microbiology, 2004,70(9):5383–5390.

[22]Kim J M, Lee H J, Kim S Y, et al.Analysis of the Fine-Scale Population Structure of “Candidatus Accumulibacter phosphatis”in Enhanced Biological Phosphorus Removal Sludge, Using Fluorescence In Situ Hybridization and Flow Cytometric [J].Applied and Environmental Microbiology, 2010,76(12):3825–3835.

[23]Martin H G, Ivanova N, Kunin V, et al.Metagenomic analysis of two enhanced biological phosphorus removal (EBPR) sludge communities [J].Nature Biotechnology, 2006,24(10):1263–1269.

[24]Zilles J L, Peccia J, Kim M W, et al.Involvement of Rhodocyclus-related organisms in phosphorus removal in full-scale wastewater treatment plants [J].Applied and Environmental Microbiology, 2002,68(6):2763–2769.

[25]Bernardet J-F, Segers P, Vancanneyt M, et al.Cutting a Gordian knot: emended classification and description of the genus Flavobacterium, emended description of the family Flavobacteriaceae, and proposal of Flavobacterium hydatis nom.nov.(basonym, Cytophaga aquatilis Strohl and Tait 1978).International Journal of Systematic Bacteriology, 1996,46(1):128-148.

[26]Jeon C O, Lee D S, Park J M.Microbial communities in activated sludge performing enhanced biological phosphorus removal in a sequencing batch reactor [J].Water Research, 2003,37(9):2195–2205.

[27]Seviour R J, Mcllroy S.The microbiology of phosphorus removal in activated sludge processes- the current state of play [J].Journal of Microbiology, 2008,46(2):115-124.

[28]Carvalho G, Lemos P C, Oehmen A, et al.Denitrifying phosphorus removal: linking the process performance with the microbial community structure [J].Water Research, 2007,41(19):4383–4396.

[29]Whang L M, Park J K.Competition between polyphosphate- and glycogen-accumulating organisms in enhanced-biologicalphosphorus-removal systems: Effect of temperature and sludge age [J].Water Environment Research, 2006,78(1):4–11.

[30]Oehmen A, Saunders A M, Vives M T, et al.Competition between polyphosphate and glycogen accumulating organisms in enhanced biological phosphorus removal systems with acetate and propionate as carbon sources [J].Journal of Biotechnology,2006,123(1):22–32.