檉柳ThERF1與其他ERF家族成員的互作

聶顯光 及曉宇 劉羽佳 劉文進 王玉成

(林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué)),哈爾濱,150040)

檉柳ThERF1與其他ERF家族成員的互作

聶顯光 及曉宇 劉羽佳 劉文進 王玉成

(林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué)),哈爾濱,150040)

通過對檉柳轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行Blast分析，得到7個與ThERF1同源的基因(ThERF4、ThERF7、ThERF11、ThERF12、ThERF13、ThERF14和ThERF16)。利用ClustalX V2.0對ThERF1和7個與其同源的基因的AP2結(jié)構(gòu)域進行多序列比對，顯示了這8個ThERF基因保守區(qū)之間的相似關(guān)系。酵母雙雜交結(jié)果表明，ThERF1能與其自身互作，還能與ThERF4、ThERF11、ThERF16互作，說明ThERF1能夠與自身或其家族成員形成同源或異源二聚體來行使功能，進而為深入研究ThERF1的耐鹽機制奠定了基礎(chǔ)。

檉柳(Tamarixhispida);酵母雙雜交;互作蛋白;二聚體

檉柳(Tamarixhispida)廣泛分布于我國西北地區(qū)的荒漠中，對干旱、鹽堿、風(fēng)蝕和沙埋等惡劣環(huán)境有抵抗力，尤其對干旱和高鹽有較強的耐受性，作為一種優(yōu)良的防風(fēng)固沙木本植物，在植物抗逆研究中具有重要的研究價值[1-2]。植物生長在自然環(huán)境中，必然受到生物脅迫和非生物脅迫的影響，包括病原菌和蟲害等生物脅迫，干旱、鹽脅迫、低溫等非生物脅迫，在這些因素的影響下，植物體內(nèi)會發(fā)生一系列生理響應(yīng)機制，以適應(yīng)這種不良環(huán)境因素[3-4]。在植物生長發(fā)育調(diào)控和應(yīng)對外部環(huán)境中轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮了重要的作用[5]。近年來對ERF轉(zhuǎn)錄因子在抗逆中作用的關(guān)注較多。研究表明，ERF轉(zhuǎn)錄因子能激活啟動子區(qū)域含有GCC-box元件和DRE元件的一系列下游基因的表達，如Sub1A-1、SNORKEL1,2、RAP2.2、HRE1等，植物在抗逆脅迫中這些基因產(chǎn)物發(fā)揮著不同的功能，提高了植物的抗逆性[6-9]，Zhang等[10]在煙草中轉(zhuǎn)入GmERF3轉(zhuǎn)錄因子，GmERF3基因過表達顯著提高了轉(zhuǎn)基因煙草對干旱、高鹽脅迫的抗性；從擬南芥中克隆的一種ERF基因HARDY，在三葉草中的過表達顯著提高了植物的耐鹽和抗旱能力[11],番茄中的ERF類轉(zhuǎn)錄因子TERF1和JERF1，過表達能夠顯著提高植物的抗?jié)B透脅迫和抗旱能力[12-13]。轉(zhuǎn)錄因子需要和自身或其他蛋白通過其寡聚化位點(oligomerization site)相互作用，這種作用對其轉(zhuǎn)錄激活以及對順式作用元件的識別具有重要作用。因此，研究與轉(zhuǎn)錄因子的互作蛋白對研究其功能有重要意義。酵母雙雜交系統(tǒng)(yeast two hybrid system)用于在酵母體內(nèi)分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的系統(tǒng)，是由Stanley Fields和Ok-kyu Song于1989年首次提出并初步建立的[14]，是目前研究蛋白與蛋白相互作用的所有遺傳方法中較為有效和應(yīng)用最廣的工具之一，不僅能夠用于已知蛋白之間的互作，最重要的在于其能與cDNA文庫結(jié)合使用，可以發(fā)現(xiàn)未知的與誘餌蛋白相互作用的蛋白。

檉柳ThERF1基因在檉柳的生長過程中發(fā)揮著重要的作用。本研究利用酵母雙雜交的方法，以檉柳ThERF1基因為誘餌蛋白，研究其是否與自身及其家族成員互作，篩選與ThERF1相互作用的蛋白質(zhì)，對探明該基因在鹽脅迫的作用機制具有重要的科學(xué)意義。

1 材料與方法

酵母菌株Y2H和Y187，酵母表達載體pGBKT7、pGADT7、pGADT7-Rec和pGBKT7-p53購自TaKaRa公司；大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α購自北京蓋寧生物公司；限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I購自Promega公司，ExTaq、DNA Marker DL2000購自TaKaRa公司；In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit和MatchmakerTM Gold Yeast Two-Hybrid System(TaKaRa)，質(zhì)粒(小量)提取試劑盒，膠回收試劑盒和PCR產(chǎn)物純化試劑盒(OMEGA)，酵母高純度質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購自北京蓋寧生物公司；X-α-Gal和Aureobasidin A(AbA)(TaKaRa)；PEG3350、DMSO、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)以及卡那霉素和氨芐霉素(Sigma)，氨基酸(BBI)，胰蛋白胨、酵母提取物(Oxoid)和瓊脂糖(Bioweat)均為國外進口試劑，其它試劑為國產(chǎn)分析純。溶液配制：RNA提取液為2% CTAB,0.012 5 mol/L硼砂,1.4 mol/L NaCl,pH=8.5,0.1% DEPC 37 ℃過夜處理。X-α-Gal儲存液：N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解X-α-Gal粉末，質(zhì)量濃度為20 mg/mL，-20 ℃避光保存。

1.1 檉柳ThERF1同源基因的序列分析

從檉柳轉(zhuǎn)錄組中獲得7個全長的與ThERF1(Genbank:KC171627)同源的基因序列。通過NCBI的ORF FINDER查找其開放讀碼框并翻譯出相應(yīng)的氨基酸序列，用ClustalX V2.0對ThERF1及其同源基因進行多序列比對。

1.2 載體的構(gòu)建

1.2.1 Bait載體的構(gòu)建

以檉柳cDNA為模板，擴增7條與ThERF1同源的基因，將Bait載體(pGBKT7)用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I酶切，將同源基因與雙酶切后的pGBKT7同源融合，用熱激法將上述反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，將經(jīng)測序正確的保存菌種，提取質(zhì)粒為后續(xù)試驗使用。

表1 構(gòu)建Bait表達載體引物

注：表中下劃線為引入的酶切位點。

1.2.2 Prey載體的構(gòu)建

以上述7條與ThERF1同源的基因為模板，擴增加有Prey表達載體(pGADT7-Rec)粘性末端同源互補序列的基因片段，將其與用SmaI單酶切的pGADT7-Rec載體同源融合，轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌，將經(jīng)測序正確的保存菌種，提取質(zhì)粒為后續(xù)試驗使用。

表2 構(gòu)建Prey載體引物及pGADT7-Rec載體AD位點兩側(cè)的引物序列

引物名稱引物序列(5’-3’)AD-ERF1-FAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCCCCAGGGATAGTA-AATCGAD-ERF1-RTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGTCAGGCCAGATCTGACGACGGAGGTAGAD-ERF4-FAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCACCCGGCATCGGAAD-ERF4-RTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGCTACGCCACCTCAGCAGAD-ERF7-FAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGCAAGACGACTTCGTCAD-ERF7-RTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGTCAATTCCAACAGCAGCAD-ERF11-FAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGAACCAACAAGCTCAAD-ERF11-RTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGTTAACATGAACTCAATAACAD-ERF12-FAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGTACAATCCAAGAAGAD-ERF12-RTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGTTAATTACTGCAGTTCAGAD-ERF13-FAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGGACGTCTCGAGGGAAD-ERF13-RTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGCTACTCCCAGAAACATGGAD-ERF14-FAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGATTCGTCATGACCATAD-ERF14-RTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGTCAATTTTTAATCAAATTCAD-ERF16-FAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGGACTGCAGGGGGAAD-ERF16-RTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGTCACTCCCAAAAACATGM5’ADCTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCCM3’ADGTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT

注：表中下劃線為引入的酶切位點。

1.3 Bait蛋白的自激活及毒性檢測

按照酵母雙雜交試劑盒MatchmakerTMGold Yeast Two-Hybrid System說明將pGBKT7質(zhì)粒和pGBKT7-ERF重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化酵母Y2H酵母細胞。將81 μL稀釋10倍、100倍的菌液涂布于直徑為90 mm的SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/X-Gal/AbA和SD/-Trp/-His的固體培養(yǎng)基，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d。

1.4 Bait與Prey載體共轉(zhuǎn)化酵母Y2H感受態(tài)細胞

按照Clontech公司酵母雙雜交手冊進行菌株Y2H感受態(tài)細胞的制備。采用LiAc方法一次進行pGBKT7-ThERF1(Bait)+pGADT7-Rec-ThERFs(Prey)和pGBKT7-ThERFs(Bait)+pGADT7-Rec-ThERF1(Prey)以pGBKT7+pGADT7-Rec為陰性對照。菌液涂布于直徑為90 mm的培養(yǎng)皿SD/-Leu/-Trp和TDO/X/A(SD/-His/-Leu/-Trp培養(yǎng)基中加X-α-Gal(終質(zhì)量濃度40 mg/L)和AbA(終質(zhì)量濃度70 μg/L))固體培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d。

1.5 陽性克隆的二次篩選

挑取TDO/X/A平板上生長狀態(tài)良好的酵母單克隆和生長于DDO/X/A篩選培養(yǎng)基上的陰性對照接種于含有Kan(50 mg/L)的TDO液體培養(yǎng)基中擴繁培養(yǎng)，取適量的培養(yǎng)物用dd H2O調(diào)整濃度至OD600值為2，并依次稀釋10、100和1 000倍后，取2 μL未稀釋和稀釋菌液點于含50 mol·L-13-AT的TDO/X/A平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d觀察酵母生長狀態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 檉柳ThERF1同源基因的序列分析

利用ClustalX V2.0對ThERF1和7個與其同源的基因的AP2結(jié)構(gòu)域進行多序列比對，顯示了這8個ThERF基因保守區(qū)之間的相似關(guān)系。并用MEGA 4.0繪制了這些基因之間的系統(tǒng)進化樹(見圖1)。根據(jù)圖1的序列比對和系統(tǒng)進化樹可以清楚地看出，ThERF1與這7個ThERF的AP2結(jié)構(gòu)域有較高的保守性，根據(jù)多序列比對的結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，ThERF16(Genbank:KC171642)、ThERF14(Genbank:KC171640)和ThERF13(Genbank:KC171639)有較近的親緣關(guān)系，ThERF1、ThERF4(Genbank:KC171630)和ThERF11(Genbank:KC171637)有較近的親緣關(guān)系，而ThERF7(Genbank:KC171633)和ThERF12(Genbank:KC171638)的親緣關(guān)系較近。

圖1 ThERF1與其他7個同源ERF基因的保守序列比對及系統(tǒng)進化樹

2.2 Bait蛋白自激活及毒性的確定

在SD/-Trp固體平板上培養(yǎng)3 d后Y2H(pGBKT7)和Y2H(pGBKT7-ERF)兩種酵母菌的長勢基本相同，說明Bait蛋白(pGBKT7-ERF)對酵母菌并沒有毒性，不影響其正常生長。在SD/-Trp/X平板上培養(yǎng)3 d后，酵母Y2H(pGBKT7)和Y2H(pGBKT7-ERF)都可正常生長且菌斑的大小基本相同，但是Y2H(pGBKT7)菌斑呈現(xiàn)白色而Y2H(pGBKT7-ERF)的菌斑則呈現(xiàn)藍色。在SD/-Trp/-His平板上，Y2H(pGBKT7)和Y2H(pGBKT7-ERF)均無法生長，如圖2。說明ThERF1能在一定程度上激活報告基因MEL1的表達，但是卻不能激活其他報告基因的表達。所以Bait蛋白(pGBKT7-ERF)在酵母體內(nèi)雖然存在部分自激活現(xiàn)象，但是并不妨礙用此雙雜系統(tǒng)進行進一步的篩選。

2.3 檉柳ThERF1互作蛋白的驗證

為了明確ThERF1與同源ThERF基因的互作關(guān)系，本研究利用酵母雙雜交技術(shù)進行篩選，將ThERF1連入pGBKT7載體內(nèi)構(gòu)建Bait載體，命名為BD-ThERF1；將從轉(zhuǎn)錄組中克隆的7個ThERF(ThERF4、ThERF7、ThERF11、ThERF12、ThERF13、ThERF14、ThERF16)基因作為Prey，構(gòu)建到pGADT7-Rec載體上，構(gòu)建7個Prey載體，命名為AD-ThERFs。將Bait與7個Prey質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化Y2H酵母感受態(tài)細胞中，轉(zhuǎn)化后的Y2H酵母菌液涂布于TDO/X/A平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d。然后挑取TDO/X/A平板上的長勢良好的藍色酵母單克隆接種于TDO液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，30 ℃、220 r/min過夜培養(yǎng)，調(diào)整濃度后分別取2 μL，并依次稀釋10、100和1 000倍后，取2 μL未稀釋和稀釋菌液點于含50 mol·L-13-AT的TDO/X/A平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d。結(jié)果如圖3-A所示：所有共轉(zhuǎn)化的酵母均能在DDO上生長，說明酵母的生理狀態(tài)及生長條件正常。但只有Bait(ThERF1)和Prey(ThERF1、ThERF4、ThERF11、ThERF16)共轉(zhuǎn)化的酵母細胞能夠在TDO/X/A篩選培養(yǎng)基上生長并呈現(xiàn)藍色(如圖3-A)，說明二者相互作。

為了進一步驗證ThERF1與其自身和其他蛋白的互作，我們互換Bait載體與Prey載體。分別以ThERF1、ThERF4、ThERF11、ThERF16作為Bait，構(gòu)建載體BD-ThERF，而將ThERF1作為Prey，構(gòu)建載體AD-ThERF1。同樣，將各Bait與Prey質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化Y2H酵母感受態(tài)細胞。與ThERF1為bait的雙雜交結(jié)果一致(圖3-B)，雙雜交后的菌落能夠在TDO/X/A上生長并呈現(xiàn)藍色，從而以上bait和prey的互作是真實的。進而表明：ThERF1可與自身形成同源二聚體并與其同家族基因ThERF4、ThERF11和ThERF16形成異源二聚體。

A為Y2H(pGBKT7-ERF)在SD/-Trp/X-α-Gal培養(yǎng)基上生長狀況;B為Y2H(pGBKT7-ERF)在SD/-Trp/-His培養(yǎng)基上的生長狀況。

(A)ThERF1作為Bait與其他ThERF之間的互作 (B)ThERF1作為Prey與其他ThERF之間的互作

圖3 酵母雙雜交分析ThERF1與其他ThERF之間的互作

3 結(jié)論與討論

蛋白與蛋白的相互作用存在于每一個細胞的生命過程中，所有的蛋白質(zhì)要發(fā)揮功能，都會通過與其他的蛋白相互作用才能實現(xiàn)，酵母雙雜交系統(tǒng)(yeast two-hybrid system)是分析蛋白相互作用的重要方法之一，為分析體內(nèi)蛋白與蛋白的相互作用了解蛋白質(zhì)功能，還可以尋找新的互作蛋白，具有準(zhǔn)確率較高、不需要抗體和純化蛋白等優(yōu)勢。自從這項技術(shù)提出以來，在篩選已知蛋白與互作蛋白的諸多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[15-16]。

1994年，JofukuKD等在分析控制擬南芥花和種子的同源基因時，發(fā)現(xiàn)了ERF的核心序列[17]，后來又發(fā)現(xiàn)ERF類轉(zhuǎn)錄因子家族的AP2和DREB轉(zhuǎn)錄因子亞家族分別行使不同的功能,前者涉及植物的發(fā)育調(diào)控和應(yīng)激信號通路[18]，后者參與激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和植物響應(yīng)非生物的脅迫[19-20]。在生命活動中，蛋白質(zhì)之間的相互作用是細胞進行一切代謝活動的基礎(chǔ)。除了有小部分蛋白可以單體的形式發(fā)揮其功能外，大部分的蛋白質(zhì)都是通過和其他蛋白的互作形成復(fù)合物來發(fā)揮作用的。以基因調(diào)控為例，在基因的表達調(diào)控過程中，細胞通過接受內(nèi)源或外源信號，通過信號傳遞，激活或抑制轉(zhuǎn)錄因子基因，最終實現(xiàn)其基因的表達，以保持其生物學(xué)特性。在這個過程中，轉(zhuǎn)錄因子占有重要的地位，它可以通過與自身或其他蛋白的互作來影響其識別的順式元件種類和順式元件的結(jié)合能力[21]。但目前,人們主要研究了ERF轉(zhuǎn)錄因子所介導(dǎo)的信號傳遞途徑以及對其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面,而對ERF蛋白的互作蛋白的研究甚少。因此,研究ERF轉(zhuǎn)錄因子的互作蛋白,將對于研究ERF的對抗逆相關(guān)基因的表達調(diào)控具有重要的意義[22]。

本實驗主要通過從檉柳轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中找到7個與ThERF1基因同源的ThERF基因序列，然后進行序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹的分析發(fā)現(xiàn)8個基因有較高的保守性，其中從系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出ThERF1與ThERF4和ThERF11的相似性最高(圖1)。而我們的雙雜交研究表明ThERF1與ThERF4和ThERF11相互作用，結(jié)果提示，ThERF1可以與與其同源性高的ERF相互作用，形成異源二聚體(圖3)。本實驗結(jié)果表明ThERF1不僅能與自身蛋白形成同源二聚體，還能與ThERF4、ThERF11、ThERF16蛋白特異性的互作(圖3)，形成異源二聚體行使功能。通過研究這些蛋白的功能,可以更好地了解ThERF1的調(diào)控機理,闡明信號傳遞網(wǎng)絡(luò)途徑,為抗逆育種提供理論依據(jù)。

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Family Interaction of ERFTamarixhispidaThERF1 with Other Members/

Nie Xianguang, Ji Xiaoyu, Liu Yujia, Liu Wenjin, Wang Yucheng

(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(8).-6～9，24

We obtained seven ERF genes by Blast analysis on the transcriptoms fromTamarixhispida, includingThERF4,ThERF7,ThERF11,ThERF12,ThERF13,ThERF14 andThERF16. By mutiple sequence alignments, ThERF1 shared high similarities in the AP2 domain with seven ERFs. By yeast two-hybrid analysis, ThERF1 can interact with itself and also interact with ThERF4, ThERF11 and ThERF16, and it can work in the forms of homodimers with itself or heterodimers with other ERFs.

Tamarixhispida; Yeast two-hybrid; Interacting protein; Dimers

聶顯光，男，1987年10月生，林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué))，碩士研究生。

王玉成，林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué))，教授。E-mail:wangyucheng@ms.xjb.ac.cn。

2013年10月28日。

Q943.2

責(zé)任編輯：潘 華。