四倍體刺槐扦插不定根發(fā)生的酶活性變化1)

王小玲 高 柱 鄭 健 劉騰云 余發(fā)新

(江西省觀賞植物遺傳改良重點實驗室(江西省科學(xué)院生物資源研究所)，南昌，330096)

四倍體刺槐扦插不定根發(fā)生的酶活性變化1)

王小玲 高 柱 鄭 健 劉騰云 余發(fā)新

(江西省觀賞植物遺傳改良重點實驗室(江西省科學(xué)院生物資源研究所)，南昌，330096)

以四倍體刺槐當(dāng)年生硬枝和半木質(zhì)化嫩枝插條為材料，探討不定根發(fā)生過程中吲哚乙酸氧化酶(IAAO)、過氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)活性的變化及其與扦插生根之間的關(guān)系，揭示四倍體刺槐扦插生根機理。結(jié)果表明：IAAO和PPO是影響四倍體刺槐扦插不定根發(fā)生的2種關(guān)鍵酶。IAAO通過調(diào)節(jié)內(nèi)源IAA(吲哚乙酸)水平來影響生根；在不定根形成過程中，硬枝插穗IAAO活性高于嫩枝；IBA處理的硬枝插穗IAAO活性高于對照，IBA處理的嫩枝插穗IAAO活性低于對照，證明內(nèi)源IAA對四倍體刺槐插穗不定根的發(fā)生具有雙重作用。PPO活性與插穗不定根的發(fā)生呈正相關(guān)；IBA處理可以顯著提高插穗PPO活性，促進生根；不定根表達期，硬枝插穗PPO活性升高，是抑制硬枝插穗不定根發(fā)生的主要原因之一。POD活性與插穗不定根發(fā)生呈弱相關(guān)。

四倍體刺槐；IAAO活性；POD活性；PPO活性

吲哚乙酸氧化酶(IAAO)、過氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)是與扦插不定根形成和生長有密切關(guān)系的3種酶[1]。IAAO能降解IAA，調(diào)節(jié)插穗體內(nèi)IAA水平[2]。POD也能氧化IAA，消除體內(nèi)過多的內(nèi)源IAA。POD作用的某些產(chǎn)物也可能是不定根發(fā)生的輔助因子，促進不定根的形成[3]。PPO是一種含銅的酶，能催化酚類物質(zhì)與IAA縮合形成一種有利于生根的輔助因子“IAA-酚酸復(fù)合物”[4]。然而，IAAO分子上具有與PPO相同的活性部位，具有與PPO同等的功能；POD的多種同工酶中表現(xiàn)出不同的性質(zhì)，或具有IAAO活性，或具有PPO活性；植物體內(nèi)IAAO也具有POD的性質(zhì)[5]。可見，這3種酶的關(guān)系密切，不定根發(fā)生和生長與這3種酶有重要的聯(lián)系。因此，研究四倍體刺槐硬枝和嫩枝扦插生根過程中這3種酶的活性變化，了解難生根樹種扦插IAAO、POD和PPO活性與生根能力大小的內(nèi)在聯(lián)系，有助于揭示四倍體刺槐扦插生根的機理。

1 材料與方法

四倍體刺槐硬枝扦插在樹液流動以前，從3年生母樹剪取當(dāng)年生枝條制穗，插穗直徑為10～12 mm，長度為12～15 cm，剪好的插穗50根為1捆捆扎。先用5 g·L-1多菌靈溶液浸泡3 min，然后用IBA 1 g·L-1溶液浸泡6 h后[6]，分3個小區(qū)扦插。扦插深度8 cm，密度400根·m-2。IBA溶液處理前隨機取5根插穗，為第0 d樣品；扦插后，第15、20、25、30、35 d分別取樣。

四倍體刺槐嫩枝扦插從3年生母樹剪取當(dāng)年生半木質(zhì)化嫩枝插條制穗，每個插穗頂端留一對復(fù)葉，每個復(fù)葉留兩片單葉，插穗直徑為8～10 mm，長度為10～12 cm，剪好的插穗30根為一捆捆扎。先用5 g·L-1多菌靈溶液浸泡3 min，然后用IBA 1.4g·L-1溶液浸泡4 h后[6]，分3個小區(qū)扦插。扦插深度5 cm，密度以兩插穗葉片不重疊為原則。IBA溶液處理前隨機取5根插穗，為第0 d樣品；扦插后，第5、10、15、20、25 d分別取樣。

以上試驗，均以清水浸泡四倍體刺槐硬枝和嫩枝插穗基部為對照(CK)。浸泡和取樣時間與IBA溶液處理的插穗相同。扦插后，在規(guī)定的取樣時間，每次每區(qū)隨機抽取9根插穗，清水沖洗干凈，迅速剝?nèi)〔逅牖? cm范圍內(nèi)的皮層，混合后分為3組，液氮冷凍后于超低溫冰箱保存。

IAAO活性測定于530 nm波長處測定吸光度(OD)值，以每克鮮質(zhì)量每小時破壞IAA的微克數(shù)表示酶活性[μg·g-1·h-1]。POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚染色法，470 nm波長測定其OD值，其活性用μg·g-1·min-1表示。PPO活性測定采用鄰苯二酚法，420 nm波長處測定其OD值，以每克鮮質(zhì)量每分鐘光密度每變化0.01為一個酶活性單位[U·g-1]。IAAO、POD和PPO活性測定參照王小玲等[7]方法。

采用Microsoft Excel 2003和SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理，LSD法比較差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 四倍體刺槐扦插IAAO活性變化

以往研究表明[8]，四倍體刺槐硬枝扦插生根的3個主要時期為：愈傷組織形成期(0～20 d)、不定根形成期(根原基誘導(dǎo)期)(20～30 d)、不定根表達和伸長期(30 d以后)；嫩枝扦插生根的3個主要時期為：愈傷組織形成期(0～10 d)、不定根形成期(10～20 d)、不定根表達和伸長期(20 d以后)。

四倍體刺槐硬枝扦插，經(jīng)1 g·L-1IBA處理的插穗，IAAO活性變化趨勢為先升高后降低(圖1)。IBA處理的插穗活性變化幅度大于對照，處理插穗IAAO活性在扦插后0～30 d急劇升高，30～35 d迅速下降；對照插穗IAAO活性在扦插后0～20 d急劇升高，20～35 d緩慢降低。整個生根過程中，處理插穗IAAO活性明顯高于對照，但方差分析表明，兩者之間插穗IAAO活性變化的差異水平不顯著(F=1.819，P=0.207 2)。四倍體刺槐嫩枝扦插，經(jīng)1.4 g·L-1IBA處理的插穗(圖2)，在根原基誘導(dǎo)期和不定根表達與伸長期，插穗IAAO活性低于對照，兩者之間IAAO活性差異水平不顯著(F=0.29；P=0.602)。IBA處理和對照插穗IAAO活性高峰出現(xiàn)在根原基誘導(dǎo)期，此時，IAAO活性最高，促進嫩枝根原基誘導(dǎo)，隨即IAAO活性降低，有利于不定根從愈傷組織伸出。

圖1 四倍體刺槐硬枝扦插IAAO活性變化

圖2 四倍體刺槐嫩枝扦插IAAO活性變化

2.2 四倍體刺槐扦插POD活性變化

四倍體刺槐硬枝扦插，經(jīng)1 g·L-1IBA處理和對照插穗POD活性呈遞增趨勢，生根不同時期POD活性變化明顯(圖3)。IBA處理插穗POD活性在扦插第15 d后始終高于對照，但處理和對照插穗之間POD活性差異不顯著(F=1.623，P=0.231 4)。四倍體刺槐嫩枝扦插(圖4)，經(jīng)1.4 g·L-1IBA處理的插穗在扦插前10 d，POD活性直線下降，10～15 d大幅度上升，15～25 d緩慢下降，扦插后第15 d形成的一個高峰，顯然參與了根原基的誘導(dǎo)；對照插穗POD活性持續(xù)下降，下降的幅度比處理插穗大。整個生根過程中IBA處理的插穗POD活性比對照高，兩者之間POD活性差異水平顯著(F=6.562，P=0.028 3)。可見，嫩枝扦插POD活性與不定根發(fā)生的關(guān)系大于硬枝。

圖3 四倍體刺槐硬枝扦插POD活性變化

圖4 四倍體刺槐嫩枝扦插POD活性變化

2.3 四倍體刺槐扦插PPO活性變化

四倍體刺槐硬枝扦插(圖5)，經(jīng)1 g·L-1IBA處理和對照插穗PPO活性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，處理插穗PPO活性高于對照，處理與對照之間插穗PPO活性差異水平極顯著(F=13.593，P=0.004 2)。愈傷組織形成期，PPO活性相繼下降，推測由于愈傷組織的形成，傷口得到愈合，因此，PPO活性維持一定的水平或略有下降；根原基誘導(dǎo)期和不定根表達與伸長期(20～35 d)，PPO活性逐漸上升。

圖5 四倍體刺槐硬枝扦插PPO活性變化

四倍體刺槐嫩枝扦插(圖6)，經(jīng)1.4 g·L-1IBA處理的插穗PPO活性顯著高于對照(F=9.211，P=0.012 6)。愈傷組織形成期，插穗PPO活性降低，催化生成的“IAA-酚酸復(fù)合物”較少，有利于愈傷組織的形成，處理和對照插穗PPO活性分別降低了8.49%和30.62%；根原基誘導(dǎo)期，插穗PPO活性升高，參與合成了大量的生根輔助因子“IAA-酚酸復(fù)合物”，有利于根原基的發(fā)育，扦插第15 d有一個明顯的峰值，處理插穗PPO活性升高顯著大于對照(F=20.321，P=0.004 1)；不定根表達與伸長期，插穗PPO活性降到最低，對照插穗PPO活性明顯低于IBA處理，說明不定根伸長期，已不需要大量生根輔助因子。

2.4 四倍體刺槐扦插IAAO、POD和PPO活性與生根的關(guān)系

四倍體刺槐扦插生根率與扦插起始期和根原基誘導(dǎo)期插穗體內(nèi)IAAO(圖7)、POD(圖8)和PPO(圖9)活性關(guān)系顯示：扦插起始期，生根率與IAAO和PPO活性呈現(xiàn)強相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別是0.74和0.63；與POD活性呈現(xiàn)非常弱的負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)是-0.06。生根率與扦插起始期IAAO、POD和PPO活性的決定系數(shù)R2分別是0.541 2、0.003 8和0.390 9，說明扦插前插穗體內(nèi)IAAO、POD和PPO活性參與不定根的發(fā)生和發(fā)展的可能性分別為54.12%、0.38%和39.09%。根原基誘導(dǎo)期，雖然生根率與IAAO、POD和PPO活性均呈現(xiàn)正相關(guān)，但相關(guān)程度不一樣。生根率與PPO活性呈現(xiàn)非常強的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)是0.89；與IAAO活性呈現(xiàn)中度相關(guān)，相關(guān)系數(shù)是0.57；與POD活性呈現(xiàn)弱相關(guān)，相關(guān)系數(shù)是0.33。生根率與根原基誘導(dǎo)期IAAO、POD和PPO活性的決定系數(shù)R2分別是0.322 4，0.108 5和0.800 1，這也說明在根原基誘導(dǎo)期，IAAO、POD和PPO活性參與不定根的發(fā)生分別有32.24%、10.85%和80.01%的可能性。由此表明，四倍體刺槐插穗生根率與IAAO和PPO活性的關(guān)系密切；扦插起始期插穗體內(nèi)IAAO活性的高低比根原基誘導(dǎo)期插穗體內(nèi)IAAO活性的高低對生根率的影響更大，即插穗自身狀態(tài)的IAAO活性對生根率的影響更大；根原基誘導(dǎo)期插穗體內(nèi)的PPO活性高低比扦插起始期插穗體內(nèi)PPO活性的高低對生根率的影響更大，即不定根誘導(dǎo)過程中提高插穗體內(nèi)PPO活性，對生根有利。

圖6 四倍體刺槐嫩枝扦插PPO活性變化

圖7 四倍體刺槐扦插IAAO活性與生根率的關(guān)系

3 結(jié)論與討論

IAAO是IAA分解代謝的關(guān)鍵酶，能氧化分解內(nèi)源IAA，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的IAA水平，保證植物的正常生長發(fā)育。Gyana[9]和劉永軍等[10]研究認為，難生根樹種插穗IAAO活性高，IAA被破壞較多，向基部輸送的IAA濃度降低，對誘導(dǎo)生根不利。相反，姚瑞玲等[12]研究難生根的鄧恩桉和易生根的尾巨桉表明，鄧恩桉插穗IAAO活性較低，對IAA濃度調(diào)節(jié)作用和不定根的誘導(dǎo)及形成作用不明顯；而尾巨桉插穗中IAAO活性高，降低了插穗IAA濃度，誘導(dǎo)不定根的形成。四倍體刺槐扦插研究發(fā)現(xiàn)，硬枝插穗不定根形成過程中IAAO活性明顯高于嫩枝，與生根過程中硬枝插穗內(nèi)源IAA濃度高于嫩枝的水平一致；經(jīng)IBA處理的硬枝插穗IAAO活性較高，能分解代謝更多的內(nèi)源IAA，IAA濃度降低，促進硬枝插穗生根[8，11]，此結(jié)果支持了姚瑞玲等[12]的研究結(jié)論；而經(jīng)IBA處理的嫩枝插穗IAAO活性較低，分解代謝的內(nèi)源IAA減少，IAA濃度升高，促進嫩枝插穗生根，與Gyana[9]的研究結(jié)論一致?？梢?，IAAO通過調(diào)節(jié)四倍體刺槐插穗體內(nèi)IAA濃度，影響扦插生根，且內(nèi)源IAA在四倍體刺槐扦插不定根形成過程中表現(xiàn)出雙重作用。

圖8 四倍體刺槐扦插POD活性與生根率的關(guān)系

圖9 四倍體刺槐扦插PPO活性與生根率的關(guān)系

POD在植物扦插生根過程中有2個重要的生理功能：一是參與生長素的代謝，起著與IAAO相同的作用，氧化消除體內(nèi)過多的IAA；二是POD活性升高，促使插穗木質(zhì)化程度提高，抑制生根。四倍體刺槐硬枝扦插POD活性持續(xù)升高，嫩枝扦插POD活性總體呈現(xiàn)下降，推測是由于硬枝插穗POD活性升高，促使組織中所含的某些碳水化合物轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素，插穗木質(zhì)化程度提高，生根率降低。研究還發(fā)現(xiàn)，硬枝和嫩枝扦插，經(jīng)不同質(zhì)量濃度IBA處理的插穗POD活性都高于對照，推測POD參與了插穗生長素代謝，氧化分解內(nèi)源IAA，使得內(nèi)源IAA在適宜的濃度范圍內(nèi)促進生根，此研究結(jié)果也支持了Metaxas et al.[13]，Syros et al.[14]和Koti et al.[15]的研究結(jié)論。還有研究認為[16]，POD作用的某些產(chǎn)物可能是不定根發(fā)生與發(fā)育所必須的輔助因子，不定根誘導(dǎo)期插穗POD活性增強是生根能力的標志。四倍體刺槐嫩枝扦插，根原基誘導(dǎo)期插穗POD活性明顯升高，促進不定根的形成，也是四倍體刺槐嫩枝扦插生根高于硬枝的原因之一[6]。

PPO可以催化生長素IAA和酚類物質(zhì)代謝，綜合形成一種有利于愈傷組織形成和不定根形成的輔助因子“IAA-酚酸復(fù)合物”。本研究中，四倍體刺槐嫩枝插穗PPO活性高于硬枝，IBA處理的硬枝和嫩枝插穗PPO活性高于對照，相關(guān)性分析表明，四倍體刺槐扦插生根與插穗PPO活性呈正相關(guān)，支持了Satisha等[17]和秦永建等[18]報道的易生根插穗PPO活性較高的結(jié)論。李仲芳等[19]研究報道，PPO的另一個作用是催化插穗愈傷組織中的多酚物質(zhì)氧化成醌，醌再轉(zhuǎn)化為羥醌，羥醌進一步聚合，生成黑色素，致使愈傷組織褐變、老化、腐爛，抑制了不定根的表達。由此推測，四倍體刺槐硬枝插穗不定根表達與伸長期PPO活性升高，抑制了不定根的表達；嫩枝插穗不定根表達與伸長期PPO活性降低，促進了不定根的表達，也是四倍體刺槐嫩枝扦插較硬枝容易的原因之一。而有關(guān)四倍體刺槐插穗PPO活性和酚類物質(zhì)的相互關(guān)系，還有待于深入研究。

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Enzymes Activity in Adventitious Roots Formation of TetraploidRobiniapseudoacaciaCuttings/

Wang Xiaoling, Gao Zhu, Zheng Jian, Liu Tengyun, Yu Faxin(Key Laboratory of Horticultural Plant Genetic and Improvement of Jiangxi Province, Institute of Biological Resources, Jiangxi Academy of Sciences, Nanchang 330096, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(1).-19～22，89

TetraploidRobiniapseudoacacia; IAAO activity; POD activity; PPO activity

1) 國家自然科學(xué)基金項目(30972352)、江西省科學(xué)院省級重點實驗室開放基金項目(2011-KLB-5)。

王小玲，女，1979年10月生，江西省觀賞植物遺傳改良重點實驗室(江西省科學(xué)院生物資源研究所)，助理研究員。

余發(fā)新，江西省觀賞植物遺傳改良重點實驗室(江西省科學(xué)院生物資源研究所)，研究員。E-mail：fxyu2000@126.com。

2013年4月1日。

S718.43； S792.26

責(zé)任編輯：任 俐。

With tetraploidRobiniapseudoacaciaof hardwood and softwood cuttings, the indole-3-acetic acid oxidase (IAAO), peroxidase (POD) and polyphenoloxidase (PPO) activity, as well as the correlations between IAAO, POD, PPO activity and rooting rate of cuttings during rooting process, were conducted to elucidate the rooting mechanism of tetraploidR.pseudoacacia. IAAO and PPO activity are closely related to the development of adventitious roots in tetraploidR.pseudoacacia. The effect of IAAO activity on rooting is regulated by the endogenous IAA. During rooting process, IAAO activity of hardwood cuttings is higher than that of softwood cuttings. IAAO activity of hardwood cuttings treated by IBA is higher than that of controls. IAAO activity of softwood cuttings treated by IBA is lower than that of controls, demonstrating the dual roles of endogenous IAA in tetraploidR.pseudoacaciacuttings. PPO activity is positively correlated to the rooting rate. IBA shows significant improvement in PPO activity to improve rooting performance in tetraploidR.pseudoacaciacuttings. One of the important reasons that the rooting rate of hardwood cuttings is lower than the softwood cuttings is its higher PPO activity in the initiation and elongation phase of adventitious roots. POD activity has relatively weak influence on the development of adventitious roots.