人參總皂苷的發(fā)酵及其產(chǎn)物的抗癌活性研究

崔磊，金護(hù)定，尹成日

(延邊大學(xué)長(zhǎng)白山生物資源與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 延吉 133002)

0 引言

人參皂苷(ginsenosides GS)是人參生理活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，也是人參成分中最有效的藥用成分.目前，已經(jīng)從人參中分離出約50種人參皂苷成分[1].藥理研究表明，人參皂苷普遍具有抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、改善記憶力[4]、抗疲勞[5]、保護(hù)神經(jīng)[6]等藥理作用.人參皂苷Rg3最初從紅參中分離得到[7]，它主要作用于細(xì)胞增殖周期的G2/M期，具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，選擇性抑制腫瘤細(xì)胞黏附和浸潤(rùn)，抑制腫瘤新生血管的形成，增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用；但這些皂苷天然含量極低，如Rg3在白參中的含量?jī)H為0.000 3%，在紅參中的含量約為0.03%，因此從人參中直接提取這些稀有皂苷較為困難.

目前，制備人參皂苷主要采用在人參中對(duì)含量較高的Rb1、Rb2、Rc、Rd等主皂苷(major ginsenosides)分子的糖基進(jìn)行選擇性水解的方法，其中微生物轉(zhuǎn)化法具有條件溫和、選擇性強(qiáng)、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)[8].侯耀達(dá)等[9]利用從林下參根部土壤中分離得到的菌株GS1-33將人參根總皂苷轉(zhuǎn)化為人參稀有皂苷C-K和Rh1.白龍律等[10]利用一種擴(kuò)展青霉(Penicilliumexpansum)GY-06將人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為Rg3.本文利用從土壤中優(yōu)選的人參皂苷生物轉(zhuǎn)化高效菌株，對(duì)人參莖葉總皂苷及人參提取物進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，并考察了其人參發(fā)酵物對(duì)結(jié)腸癌colon26-M3.1細(xì)胞的抑制作用.

1 材料與方法

1.1 材料

土壤樣品采集于長(zhǎng)白山園參、移山參根部土壤以及長(zhǎng)白山溫泉土樣.

1.2 試劑

人參莖葉總皂苷和人參皂苷購(gòu)于成都思科華生物技術(shù)有限公司，人參購(gòu)于延吉市參茸市場(chǎng)，薄層層析板Silica gel 60-F254購(gòu)于德國(guó)Merck公司，營(yíng)養(yǎng)瓊脂、R2A瓊脂、YM瓊脂和MRS瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)于Sigma公司，實(shí)驗(yàn)中所用化學(xué)試劑均為分析純.

1.3 儀器

儀器有：立式電熱壓力蒸汽滅菌器(LDZX- 30KB，上海申安醫(yī)療器械)；生物安全柜(BSC-1300 Ⅱ A/B3)；pH計(jì)(雷磁PHS-3C型)；電子天平(JA5003型，上海良平儀器儀表有限公司)；高速離心機(jī)(MCD-2000 HSIANGTAI)；液相色譜儀(LC-6A，日本島津)；振蕩培養(yǎng)箱(HZQ-C，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)；分析天平(Sartorius BT 224 S)；ALT試劑盒、AST試劑盒(購(gòu)于南京建成生物工程研究所)；SP-4430全制動(dòng)生化分析儀(日本ARKRAY公司)；PCR儀(TC-512，英國(guó)Techne公司)；光學(xué)顯微鏡(BX61 Olymps Cooperation Made In Japan)；酶標(biāo)儀(FLx 800，基因有限公司)；MALDI-TOF-MS (Voyager DE-STR，日本導(dǎo)津).

1.4 微生物的分離篩選

將采集的土樣利用十倍稀釋法進(jìn)行稀釋，將稀釋液分別接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂、R2A、YM瓊脂和MRS瓊脂培養(yǎng)基上，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，隨后挑取單個(gè)菌落傳代；重復(fù)以上操作數(shù)次，得到純培養(yǎng)的菌種[11].根據(jù)七葉苷顯色原理[12]，七葉苷被β-葡萄糖苷酶水解后生成葡萄糖和6,7-二羥香豆素(七葉苷元)，七葉苷元遇到鐵離子生成黑色物質(zhì).把分離出的單一菌株涂在由七葉苷修飾的R2A瓊脂(E-R2A)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，瓊脂培養(yǎng)基成分包括R2A瓊脂15.2 g，七葉苷1.0 g，檸檬酸鐵0.5 g.觀察培養(yǎng)基的顏色變化，變成黑色的即為具有β-葡萄糖苷酶活性的菌株，且顏色越黑，活性越強(qiáng).

1.5 人參莖葉總皂苷的微生物轉(zhuǎn)化

配制pH 7.0的液體培養(yǎng)基，加入10 g/L的人參莖葉總皂苷，然后分裝在250 mL三角瓶中，每瓶50 mL；高壓滅菌，冷卻至室溫后，接種5 mL產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株培養(yǎng)液，放置于30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)器中發(fā)酵.每隔2 d取樣品，連續(xù)取5次，離心后取上清液，然后用TLC和HPLC測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中人參皂苷的變化.液體培養(yǎng)基成分為：NH4Cl (0.5 g/L)，KH2PO4(0.5 g/L)，K2HPO4(1 g/L)，MgSO4·7H2O (0.25 g/L)，酵母膏(1 g/L).

1.6 人參提取物的微生物轉(zhuǎn)化

取25 g鮮參(或5 g干參)加入250 mL蒸餾水，用保鮮膜密封后置于恒溫培養(yǎng)箱中，24 h后過(guò)濾得到人參提取物.將提取物用1 mol/L HCl處理，得到酸處理后的人參提取物.然后，利用產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株分別對(duì)人參提取物和酸處理后的人參提取物進(jìn)行發(fā)酵，得到兩種人參發(fā)酵物.

1.7 薄層色譜法(TLC法)測(cè)定人參皂苷

將人參稀有皂苷Rg3和Rh2的標(biāo)準(zhǔn)品配成混合標(biāo)準(zhǔn)品醇溶液.將樣品與標(biāo)準(zhǔn)品溶液在TLC板上同時(shí)展開，展開劑為體積比為10∶5∶1的氯仿、甲醇、水混合液，吹干后用10%(體積比)的硫酸乙醇溶液顯色，并與標(biāo)準(zhǔn)品Rf值比對(duì)，以此檢驗(yàn)稀有人參皂苷Rg3和Rh2是否生成.

1.8 高效液相色譜法(HPLC法)測(cè)定人參皂苷

高效液相色譜儀HP 1100，UV檢測(cè)器，色譜柱采用BDS HYPERSIL C18柱 (250 mm×4.6 mm)，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm，流速為0.8 mL/min，柱溫為30 ℃，流動(dòng)相為0.001%甲酸-乙腈溶液，梯度洗脫(條件如表1).

表1 高效液相色譜梯度洗脫條件

1.9 人參發(fā)酵物對(duì)結(jié)腸癌colon26-M3.1細(xì)胞的抑制作用

選取菌株YS2、YS5、YS7和YS8對(duì)人參提取物和酸處理后的人參提取物進(jìn)行發(fā)酵轉(zhuǎn)化，發(fā)酵8 d后，將發(fā)酵液離心，滅菌，凍干成粉末得到人參發(fā)酵物.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，消化后接種細(xì)胞于96孔板中，加入不同濃度的人參發(fā)酵物培養(yǎng).加入噻唑藍(lán)(MTT)溶液孵育后，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，根據(jù)公式：細(xì)胞存活率/%=(實(shí)驗(yàn)孔測(cè)定值/對(duì)照孔測(cè)定值)×100,計(jì)算結(jié)腸癌colon26-M3.1細(xì)胞存活率[13]，并計(jì)算50%細(xì)胞存活率時(shí)的發(fā)酵物的濃度(IC50).

1.10 菌株的形態(tài)學(xué)觀察及ITS測(cè)序

在光學(xué)顯微鏡下觀察菌株YS2菌體的大小、形態(tài)及孢子形態(tài).采用氯化芐法[14]提取YS2菌株基因組總DNA，使用nested-PCR擴(kuò)增ITS序列[15].先用引物NSA3 (5′-AAA CTC TGT CGT GCT GGG GAT A-3′)和NLC2 (5′-GAG CTG CAT TCC CAA ACA ACT C-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR反應(yīng)體系(25 μL)為：2X Taq PCR MasterMix (TIANGEN) 12.5 μL，MgCl2(25 mΜ)1 μL，引物為NSA3 (5 μΜ)和NLC2 (5 μΜ)各1 μL，DNA模板1 μL，超純水8.5 μL.PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，20個(gè)循環(huán)；72 ℃ 15 min.采用PCR純化試劑盒(Bioneer公司)純化PCR產(chǎn)物，送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序.

將測(cè)得的基因序列通過(guò)Blast程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比分析，相似的序列進(jìn)行多重匹配排列分析(clustalx 1.83)[16].用Mega 4.0[17]分析軟件中的Neighbor Joining方法[18]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物的分離與篩選

從采集的長(zhǎng)白山土壤樣品中共分離得到256種菌株，且篩選出102種產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株.在其中挑選出14種β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株(編號(hào)為YS1-YS14)進(jìn)行人參莖葉總皂苷和人參提取物的微生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn).

2.2 人參莖葉總皂苷和人參提取物中人參皂苷的含量分析

用HPLC分析人參莖葉總皂苷水溶液10 g/L，其主要成分及含量見表2.人參提取物中人參皂苷的含量見表3.由表3可知，鮮參和干參提取物中均含有較高含量的Rb1、Rb2和Rd，且干參中人參皂苷的含量比鮮參高.

表2 人參莖葉總皂苷中人參皂苷含量 μg/mL

表3 人參提取物中人參皂苷含量 μg/mL

2.3 人參莖葉總皂苷的微生物轉(zhuǎn)化

在14種高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株中，YS2、YS12、YS13和YS14菌株對(duì)人參莖葉總皂苷具有較好的轉(zhuǎn)化作用，其中菌株YS2的轉(zhuǎn)化效果最好.利用菌株YS2發(fā)酵人參莖葉總皂苷的產(chǎn)物為稀有人參皂苷Rg3 (圖1)，并且發(fā)酵2 d后Rg3的產(chǎn)率達(dá)到最高值(見表4).利用MALDI-TOF-MS進(jìn)一步確定發(fā)酵產(chǎn)物Rg3 (分子量785.02)，在負(fù)離子模式下，分子離子峰([M+35Cl]-=818.1)與同位素峰([M+37Cl]-=820.1)的峰高比值為3∶1，由此可知產(chǎn)物的分子量與Rg3吻合(見圖2).

圖1 菌株YS2發(fā)酵人參莖葉總皂苷的HPLC譜圖:(A)為發(fā)酵前；(B)為發(fā)酵2 d后

表4 YS2對(duì)人參莖葉總皂苷的轉(zhuǎn)化 μg/mL

圖2 發(fā)酵產(chǎn)物的MALDI-TOF-MS譜圖

2.4 人參提取物的微生物轉(zhuǎn)化

本文對(duì)人參發(fā)酵采取了直接發(fā)酵和酸處理后發(fā)酵的兩種方法.發(fā)酵前的人參提取物中主要含有人參皂苷Rb1、Rb2和Rd，未含有稀有人參皂苷Rg3和Rh2 (見表3).菌株YS2、YS5、YS7和YS8均能將人參中的Rb1、Rb2、Rd轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷Rg3，其中菌株YS2的轉(zhuǎn)化率最高，并且菌株YS2、YS7和YS8對(duì)酸處理后的人參顯示出更高的轉(zhuǎn)化率(見表5).

表5 人參發(fā)酵物中稀有人參皂苷的含量

2.5 人參發(fā)酵物對(duì)結(jié)腸癌colon26-M3.1細(xì)胞的抑制作用

IC50值可以用來(lái)衡量藥物誘導(dǎo)凋亡的能力，即誘導(dǎo)能力越強(qiáng)，該數(shù)值越低.菌株YS2、YS5、YS7和YS8的人參發(fā)酵物對(duì)結(jié)腸癌colon26-M3.1細(xì)胞均有較強(qiáng)的抑制作用，其IC50值如表6所示.從表6中可以看出：菌株YS2和YS7的人參發(fā)酵物(酸處理后發(fā)酵)對(duì)結(jié)腸癌colon26-M3.1細(xì)胞的IC50值分別為180 μg/mL和170 μg/mL，具有很強(qiáng)的抑制活性(文獻(xiàn)值為730 μg/mL)[13]；其次是菌株YS8的人參發(fā)酵物(IC50值為220 μg/mL)；其余發(fā)酵產(chǎn)物的抑制作用相對(duì)弱一些.分析表明，人參發(fā)酵物對(duì)結(jié)腸癌colon26-M3.1細(xì)胞的抑制活性直接與人參發(fā)酵物中稀有人參皂苷Rg3的含量有關(guān).

表6 人參發(fā)酵物對(duì)結(jié)腸癌colon26-M3.1細(xì)胞的抑制濃度(IC50) μg/mL

2.6 菌株YS2的形態(tài)學(xué)觀察及其ITS測(cè)序鑒定

菌株YS2在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)旺盛，呈絲狀、白色(見圖3).菌絲細(xì)長(zhǎng)，分隔，分枝，淡色；分生孢子梗由菌絲頂端生成或從菌絲側(cè)壁產(chǎn)生，直立，不分枝(見圖4).

圖3 YS2菌PDA培養(yǎng)基上的菌落

圖4 YS2菌的分生孢子

菌株YS2的ITS序列如下：

>YS2_NLB4_1

CTCCTGGTCGTCTGGGATAAAGCATGCAATTATGCTTTCAACGAGGATGCCTAGTAAGCGCGTGTCATCAGCATGGTTTGATTACGTCCCTGACCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTCAGTGAGGCCTTCGGCTGCTCGAGGAGGTTGGCAAGACCACCTCAAGCCGGAAAGTTCGTCAAACTCGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACACAAATATGAAGGCGGGCTGGAACCTCTCGGGGTTACAGCCTTGCTGAATTATTCACCCTTGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCTTGGTGGGTTCGCCCACCACTAGGACAAACATAAACCTTTTGTAATTGCAATCAGCGTCAGTAACAAATTAATAATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTCTTGTCTCTAGCTTTGCTGGAGACTCGCCTTAAAGTAATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAAGTCGCACTCTCTATCAGCAAAGGTCTAGCATCCATTAAGCCTTTTTTTCAACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCTAGTAACGGCGAGGAAGCTTCTTTTTTTTCGAATTTGAAA.

菌株YS2的ITS序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明(圖5)，該菌株歸屬于鏈格孢屬(Alternaria).

圖5 菌株YS2的無(wú)根系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論

本文利用β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株將人參莖葉總皂苷和人參提取物中的人參皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷Rg3，研究表明，經(jīng)酸處理后的人參顯示出更高的轉(zhuǎn)化率.菌株YS2和YS7的人參發(fā)酵物對(duì)結(jié)腸癌colon26-M3.1細(xì)胞具有很強(qiáng)的抑制作用，其IC50值分別為180 μg/mL和170 μg/mL.經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和ITS序列分析，確定菌株YS2為鏈格孢屬(Alternaria).本研究對(duì)利用微生物轉(zhuǎn)化法提高人參的生物活性和制備抗腫瘤稀有人參皂苷均具有一定的意義.

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