基于細(xì)菌展示技術(shù)的高通量抗原表位篩選方法的建立

郭 茉 徐黎明 周 兵 尹杰超 任桂萍 李德山

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物制藥教研室，哈爾濱150030)

抗原表位又稱(chēng)抗原決定簇 ，是抗原分子上能夠被抗體分子識(shí)別的特定區(qū)域［2］，在蛋白質(zhì)抗原中一般由幾個(gè)直接相鄰或構(gòu)象上相鄰的氨基酸組成，是誘導(dǎo)體液免疫的基本單位，決定機(jī)體產(chǎn)生抗體的特異性。對(duì)一些特定病毒的蛋白質(zhì)抗原而言，鑒定其抗原表位有利于揭示病毒體液免疫的本質(zhì)。表位是蛋白質(zhì)抗原性的基礎(chǔ)，正確而詳細(xì)地繪制抗原表位圖譜對(duì)疾病的診斷、定點(diǎn)改造蛋白質(zhì)分子以降低蛋白質(zhì)藥物的免疫原性，設(shè)計(jì)無(wú)毒副作用的人工疫苗以及免疫干預(yù)治療等有積極的意義。傳統(tǒng)的抗原表位鑒定方法如抗原缺失突變、合成肽段掃描(PEPSCAN)、抗原的酶解等均需對(duì)多肽片段進(jìn)行表達(dá)和純化［3］，周期長(zhǎng)，工作量大。

本研究擬利用細(xì)菌展示技術(shù)結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù)建立一種無(wú)需蛋白/多肽表達(dá)的高效抗原表位篩選方法。細(xì)菌展示技術(shù)又稱(chēng)以細(xì)胞內(nèi)膜為基礎(chǔ)的細(xì)胞間質(zhì)表達(dá)技術(shù)(Anchored periplasma expression technology，APEx)。該技術(shù)特點(diǎn)是以細(xì)胞間質(zhì)膜脂蛋白的信號(hào)肽NlpA leader和6個(gè)成熟氨基酸的作用將與之融合的蛋白片段錨定展示于細(xì)菌內(nèi)膜外側(cè)。NlpA leader在蛋白跨膜運(yùn)輸過(guò)程中被逐步降解，剩下的6個(gè)成熟氨基酸(CDQSSS)與細(xì)胞內(nèi)膜外側(cè)的磷脂層形成脂苷鍵，從而將與其融合的蛋白片段展示于細(xì)菌內(nèi)膜外側(cè)［4］。當(dāng)細(xì)菌外膜被溶菌酶消化(原生質(zhì)體制備)以后，孵育液中的抗原特異性多克隆抗體可與錨定在細(xì)胞內(nèi)膜外側(cè)的蛋白片段結(jié)合，然后將其與熒光標(biāo)記的二抗進(jìn)行共孵育，抗原-抗體復(fù)合物作用強(qiáng)度不同所產(chǎn)生的不同強(qiáng)度的熒光信號(hào)可被FC檢測(cè)和識(shí)別。與噬菌體肽庫(kù)篩選抗原表位相比，細(xì)菌展示技術(shù)可以配合熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)(Fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)進(jìn)行更快速、更高效的篩選。由于流式細(xì)胞術(shù)高度的靈敏度、高通量(最快每秒3萬(wàn)個(gè)細(xì)胞)和準(zhǔn)確分選的優(yōu)勢(shì)，目前細(xì)菌展示技術(shù)已廣泛應(yīng)用于抗體庫(kù)的構(gòu)建、提高抗體親和力、研究蛋白之間相互作用、疫苗研制、篩選和制備等多種領(lǐng)域［5］。

本實(shí)驗(yàn)將傳染性法氏囊病病毒表面蛋白VP2基因分為連續(xù)、不重疊、大小相似的5個(gè)片段，利用細(xì)菌展示技術(shù)結(jié)合FC對(duì)將VP2進(jìn)行抗原表位分析，結(jié)果提示 V1、V3、V4、V5四個(gè)片段存在抗原表位，V2不存在抗原表位;利用Western blot直接檢測(cè)細(xì)菌周質(zhì)腔中內(nèi)參Flag tag的表達(dá)情況，排除了表達(dá)量對(duì)FC檢測(cè)中熒光強(qiáng)度的影響;為了證實(shí)FC檢測(cè)結(jié)果的真實(shí)性，本研究應(yīng)用傳統(tǒng)篩選方法［6］對(duì)VP2片段進(jìn)行表達(dá)、純化，利用Western blot對(duì)其抗原表位進(jìn)行鑒定，并且利用DNAStar軟件分析各片段的抗原性及親水性，預(yù)測(cè)其可能存在的抗原表位。結(jié)果顯示傳統(tǒng)方法和軟件分析結(jié)果與FC檢測(cè)結(jié)果一致，該結(jié)果說(shuō)明了本研究成功地建立了快速、高效的抗原表位篩選方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 抗IBDV多克隆抗體(哈爾濱獸醫(yī)研究所饋贈(zèng))，E.coli DH5α，重組質(zhì)粒 pMD18-TVP2(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)，克隆載體pTlinker和細(xì)菌表面展示載體 pAPEx(本實(shí)驗(yàn)室保存)，F(xiàn)ITC-Rabbit anti-Chicken antibody(Santa Cluz，USA)，Mouse anti-FLAG antibody(Sigma，UK)，HRP-rabbit antichicken IgG(H+L)(購(gòu)自 R＆D公司)，HRP-goat anti-mouse IgG(H+L)(購(gòu)自R＆D公司)。

1.1.2 酶和生化試劑 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase購(gòu)自New England BioLabs公司;Taq DNA聚合酶、dNTP Mixture、DNA marker、IPTG、氨芐青霉素、氯霉素(均購(gòu)自TaKaRa公司);牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自Sigma Corporation;丙烯酰胺、甲基雙丙烯酰胺、TEMED、過(guò)硫酸銨、DTT、考馬斯亮藍(lán)R-250(購(gòu)自 Amersham Pharmacia Biotech公司);Peroxidase-conjugated AffiniPure Rabbit Anti-Chicken IgY(IgG)(Jackson ImmunoResearch公司，lot#67092);質(zhì)粒提取試劑盒(購(gòu)自O(shè)MEGA公司);DNA回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒(購(gòu)自Qiagen公司);酵母提取物、胰蛋白胨、低熔點(diǎn)瓊脂糖等購(gòu)自北京原平皓生物工程公司;低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Fermenta公司;其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 分段擴(kuò)增IBDV VP2基因根據(jù)GenBank上已發(fā)表的 VP2序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件 Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)5對(duì)PCR引物如表1，將VP2基因分為5段，即V1(1～251 bp)、V2(252～504 bp)、V3(508～756 bp)、V4(757 ～1 008 bp)、V5(1 018 ～1 314 bp)引物序列及在VP2基因中位置如表1所示，在正向引物的5'端引入HindⅢ位點(diǎn)，在反向引物的5'端引入XhoⅠ位點(diǎn)，并在引物中加入Flag tag基因序列，引物由生工生物技術(shù)有限公司合成。采用常規(guī)PCR方法以重組質(zhì)粒pMD18-T-VP2為模板分別擴(kuò)增5段基因，各取1μl產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳上觀察片段大小。

1.2.2 重組 pTlinker-VP2質(zhì)粒的制備 取20μl PCR產(chǎn)物(濃度約為100 ng/μl)進(jìn)行純化，純化步驟參照Axygen PCR Purification Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取PCR純化產(chǎn)物用HindⅢ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切。利用1%瓊脂糖回收片段，按TIANGEN DNA回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將膠回收后的5個(gè)片段與線性克隆載體pTlinker進(jìn)行16℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)菌并設(shè)置對(duì)照組，涂布于含有100μg/ml Amp的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12～16 h。隨機(jī)挑取數(shù)個(gè)單菌落，分別接種于含100 μg/ml Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，收集菌體提取質(zhì)粒。對(duì)提取質(zhì)粒分別進(jìn)行PCR和HindⅢ/XhoⅠ雙酶切鑒定。

1.2.3 重組pAPEx-VP2質(zhì)粒的制備 利用Sfi I分別對(duì)pTlinker-vp2(V1-V5)和pAPEx進(jìn)行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行膠回收并連接，轉(zhuǎn)化DH5α，涂布平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，構(gòu)建出pAPEx-VP2重組質(zhì)粒。

1.2.4 VP2基因片段細(xì)菌展示及FACS檢測(cè) 取轉(zhuǎn)化有pAPEx-VP2重組質(zhì)粒的菌落用LB液體培養(yǎng)基稀釋至 OD600≈0.2，37℃培養(yǎng)使之 OD600≈0.4，加入IPTG至終濃度為2.5 mmol/L，37℃培養(yǎng)4 h。在1.5 ml Eppendorf管中加入 1.5 ml培養(yǎng)物，6 000 r/min離心3 min，去掉上清。菌體沉淀用350μl Sucrose(0.75 mmol/L)/Tris(0.1 mol/L)solution 重懸;加入35μl濃度為10 mg/ml新鮮配制的溶菌酶母液;逐滴加入700μl 1 mmol/L EDTA溶液，同時(shí)渦旋混勻;冰上孵育15 min;加入 50 μl，0.5 mol/L MgCl2溶液，并在冰上孵育10 min;4℃，10 000 r/min離心10 min;原生質(zhì)球沉淀用1 ml PBS溶液重懸洗滌，6 000 r/min離心3 min，去上清;原生質(zhì)球沉淀用100μl PBS重懸。細(xì)菌細(xì)胞壁被溶菌酶打孔后形成原生質(zhì)球，此時(shí)抗原、抗體等物質(zhì)均可透過(guò)細(xì)胞壁與細(xì)胞膜相接觸發(fā)生反應(yīng)。在100μl PBS重懸的菌液(已誘導(dǎo))中加入10μl 1%(質(zhì)量體積比)BSA貯存液、0.2 μl IBDV 多抗(終濃度為 1 ng/μl)，冰上孵育1 h;8 000 r/min，離心3 min，1 ml PBS重懸洗滌一次，沉淀用100μl PBS，加入10μl 1%(質(zhì)量體積比)BSA貯存液、FITC標(biāo)記兔抗雞二抗冰上避光孵育1 h，8 000 r/min，離心 3 min，1 ml PBS 重懸洗滌三次，沉淀用1 ml PBS重懸。設(shè)置陰性對(duì)照，將空白DH5α(不含pBSD-VP2重組質(zhì)粒)處理成為原生質(zhì)球后用FITC標(biāo)記兔抗雞二抗孵育。用流式細(xì)胞儀于488 nm波長(zhǎng)激光下檢測(cè)樣品及陰性對(duì)照的熒光強(qiáng)度，收集樣品中熒光強(qiáng)度高于陰性對(duì)照的部分。

1.2.5 VP2 截短片段Flag標(biāo)簽Western blot檢測(cè) 取1.2.4中IPTG誘導(dǎo)后所得菌體1 ml，破碎后經(jīng)15%SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)，用1%BSA/PBS的封閉液室溫封閉1 h，加入一抗(Mouse anti-FLAG antibody)，于4℃孵育過(guò)夜。PBST洗膜3次，每次5 min，再加入二抗［HRP-goat anti-mouse IgG(H+L)］，于 37℃ 溫育1 h，PBST和PBS先后洗膜4次后，ECL化學(xué)發(fā)光曝光。

1.2.6 VP2截短片段的表達(dá)純化 根據(jù)VP2序列設(shè)計(jì)5對(duì)引物，上下游分別引入HindⅢ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)如表2，利用PCR對(duì)VP2進(jìn)行擴(kuò)增。將5個(gè)VP2片段分別克隆至pET-27b表達(dá)載體中進(jìn)行表達(dá)。將重組質(zhì)粒pET-27b-VP2轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株Rosetta中，挑單菌落接種至5 ml LB培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。以1∶100接種于500 ml含氨芐青霉素(100μg/ml)LB培養(yǎng)基中 37℃培養(yǎng)至 OD600=0.2～0.4 時(shí)，加入 IPTG 至終濃度為 0.25 mmol/L，37℃進(jìn)行誘導(dǎo)，于不同時(shí)間取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳以確定最佳表達(dá)時(shí)間。菌體用PBS(10 mmol/L咪唑)重懸并加溶菌酶至終濃度為1 mg/ml，冰上放置30 min，超聲破碎，8 000 r/min 4℃離心30 min，收集包涵體，洗滌后用8 mol/L尿素溶解，加入到10倍體積的復(fù)性液(10 mmol/L Tris-buffer，pH8.0)中復(fù)性24 h，再經(jīng) PBS(pH7.4)4℃透析 3 次，8 h/次。純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度。

表1 構(gòu)建p APEx-VP2重組質(zhì)粒引物Tab.1 Primers used in pAPEx-VP2 construction

1.2.7 截短VP2片段Western blot檢測(cè) VP2抗原多肽片段經(jīng)18%SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)，用1%BSA/PBS的封閉液室溫封閉1 h，加入一抗(抗IBDV多克隆抗體)，于4℃孵育過(guò)夜。PBST洗膜3次，每次5 min，再加入二抗(HRP-rabbit anti-chicken IgG(H+L)購(gòu)自 R＆D公司)，于37℃溫育1 h，PBST和 PBS先后洗膜4次后，ECL化學(xué)發(fā)光曝光。

表2 構(gòu)建p ET-27b-VP2重組質(zhì)粒引物Tab.2 Primers used in pET27b-VP2 construction

圖1 p Tlinker-VP2 PCR鑒定Fig.1 Identification of p Tlinker-VP2 by PCR

1.2.8 生物信息學(xué)軟件對(duì)VP2截短片段的抗原性分析 將V1～V5的氨基酸序列分別輸入DNAStar protein分析界面，點(diǎn)擊生成分析圖像。

2 結(jié)果

2.1 重組pTlinker-VP2質(zhì)粒的PCR鑒定 對(duì)陽(yáng)性重組質(zhì)粒pTlinker-VP2(V1～V5)進(jìn)行PCR鑒定可分別得到 252、252、252、252、306 bp 目的片段，符合預(yù)期大小(圖1)。

2.2 重組pAPEx-VP2質(zhì)粒PCR鑒定 對(duì)陽(yáng)性重組質(zhì)粒pAPEx-VP2(V1～V5)進(jìn)行PCR鑒定可分別得到252、252、252、252、306 bp 目的片段，符合預(yù)期大小(圖2)。

2.3 VP2基因5個(gè)片段細(xì)菌展示庫(kù)的篩選 將含有pAPEx-VP2的陽(yáng)性菌誘導(dǎo)表達(dá)后制備原生質(zhì)體，分別用IBDV多抗及FITC-rabbit anti-chicken進(jìn)行孵育，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照(pAPEx-IL-1β)，以同樣方法孵育。以陰性對(duì)照為標(biāo)準(zhǔn)，將陽(yáng)性菌經(jīng)流式細(xì)胞儀于488 nm波長(zhǎng)激光下進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖3。由結(jié)果可見(jiàn)，陽(yáng)性菌主峰相對(duì)陰性主峰有移動(dòng)，說(shuō)明陽(yáng)性菌中可表達(dá)能與IBDV多抗特異性結(jié)合的VP2蛋白。V3與V4主峰移動(dòng)位移最大所以熒光信號(hào)強(qiáng)度最高，V5熒光信號(hào)略弱于V3、V4且強(qiáng)于V1，V2熒光信號(hào)強(qiáng)度最弱。

圖2 pAPEx-VP2 PCR鑒定Fig.2 Identification of p APEx-VP2 by PCR

圖3 VP2截短片段Fcm檢測(cè)Fig.3 Flow cytometric analysis of binding property of truncated VP2 fragments with pAb

圖4 VP2-Flag標(biāo)簽Western blot檢測(cè)Fig.4 Western blot analysis of truncated VP2-Flag fusions expressing in APEx system

2.4 VP2截短片段FLAG標(biāo)簽Western blot檢測(cè)見(jiàn)圖4。

2.5 VP2截短片段與抗IBDV多克隆抗體Western blot檢測(cè) 見(jiàn)圖5。

圖5 VP2片段Western blot檢測(cè)Fig.5 Western blot analysis of the truncated VP2 fragments

2.6 生物信息學(xué)軟件對(duì)V1～V5片段的抗原性分析 將V1～V5的氨基酸序列輸入DNAstar protein分析界面，生成如圖6結(jié)果。Antigenic Index表示其抗原性強(qiáng)弱，圖中峰區(qū)表示潛在的抗原表位，峰值越高則抗原性越強(qiáng)，峰區(qū)越多則潛在的表位越多。V1、V3、V4、V5均含有 3至 4個(gè)較高峰值區(qū)，V2段僅含有一個(gè)峰區(qū)。Hydrophilicity plot代表親水區(qū)域，由圖6可見(jiàn)V1、V3、V4、V5含有1至3個(gè)不等的親水區(qū)，V2段不含有親水區(qū)。

圖6 DNAStar對(duì)VP2截短片段的抗原性預(yù)測(cè)Fig.6 DNAStar analysis of potential epitopes in VP2

3 討論

常用的抗原表位篩選方法包括:抗原的裂解，固相多肽掃描，噬菌體肽庫(kù)篩選等。傳統(tǒng)的方法是應(yīng)用化學(xué)(溴化氰)和酶法裂解蛋白質(zhì)，獲得多肽片段，再用單克隆抗體或多克隆抗體通過(guò)SDS-PAGE和Western blot或 ELISA檢測(cè)其反應(yīng)性［4］，以確定抗原表位，此種方法必須要對(duì)抗原進(jìn)行表達(dá)和純化，且后續(xù)檢測(cè)程序繁瑣，一般需要1年左右時(shí)間。目前，應(yīng)用合成多肽技術(shù)檢測(cè)抗原表位雖然擴(kuò)大了檢測(cè)的容量，但是需要合成大量多肽，成本較高，而且需要多種針對(duì)不同表位的單克隆抗體，在一定程度上限制了篩選的多樣性。本研究利用細(xì)菌間質(zhì)展示技術(shù)將待檢測(cè)蛋白分段展示于細(xì)菌間質(zhì)內(nèi)，利用多克隆抗體作為檢測(cè)分子，熒光標(biāo)記二抗作為篩選分子進(jìn)行FC檢測(cè)，無(wú)需對(duì)蛋白片段進(jìn)行純化，縮短了試驗(yàn)周期，提高了效率。此外，流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用使得篩選過(guò)程更為直觀，且高通量。與噬菌體肽庫(kù)篩選技術(shù)相比，F(xiàn)C具有以下特色［7］:(1)高富集比。通常認(rèn)為FC篩選每輪的富集比為103～104，而常規(guī)的生物淘洗每輪的富集比僅為200～500;(2)高陽(yáng)性率。Franscisco等在1993年的研究顯示，經(jīng)過(guò)兩輪篩選陽(yáng)性率高達(dá)95%［8］，這是常規(guī)生物淘洗所無(wú)法想象的;(3)由于反應(yīng)在溶液狀態(tài)下進(jìn)行，可克服常規(guī)生物淘洗過(guò)程中由于篩選配基固定化而導(dǎo)致的“親和效應(yīng)”［9］。應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行篩選可以真正地做到實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)同步跟進(jìn)，非常直觀的追蹤抗原表位的甄別情況。

本研究中的V1～V5在VP2氨基酸序列上定位分別為:1～84，85～168，170～252，253～336，340～438。根據(jù)流式細(xì)胞儀篩選結(jié)果本實(shí)驗(yàn)得出以下結(jié)論:V3與V4熒光信號(hào)強(qiáng)度最高，V5熒光信號(hào)略弱于V3、V4且強(qiáng)于V1，V2熒光信號(hào)強(qiáng)度最弱(圖3)。V1、V3、V4、V5四段熒光信號(hào)均達(dá)到一定強(qiáng)度說(shuō)明這四個(gè)片段中可能存在有多個(gè)抗原表位，V3及V4段熒光信號(hào)較強(qiáng)說(shuō)明存在優(yōu)勢(shì)表位，V2段熒光信號(hào)與陰性對(duì)照比并無(wú)明顯加強(qiáng)說(shuō)明該段中不存在抗原表位。FC檢測(cè)的熒光信號(hào)是抗原-抗體結(jié)合作用和抗原表達(dá)量的共同結(jié)果，F(xiàn)lag標(biāo)簽的Western blot結(jié)果顯示VP2各片段均能成功的錨定表達(dá)于細(xì)菌內(nèi)膜上，并且表達(dá)量無(wú)明顯差異(圖4)，因此不同片段的熒光強(qiáng)度完全取決于該蛋白片段與多克隆抗體的相互作用。應(yīng)用傳統(tǒng)方法對(duì)VP2抗原進(jìn)行分段表達(dá)及抗原表位的篩選，結(jié)果顯示V2段不與多克隆抗體反應(yīng)(圖5)，說(shuō)明其不含有抗原表位。生物信息學(xué)軟件DNAstar的分析結(jié)果中Antigenic Index表示其抗原性強(qiáng)弱，圖中峰區(qū)表示潛在的抗原表位，峰值越高則抗原性越強(qiáng)，峰區(qū)越多則潛在的表位越多。V1、V3、V4、V5均含有 3至 4個(gè)較高峰值區(qū)，V2段僅含有一個(gè)峰區(qū)(圖6)。Hopp等［10］通過(guò)對(duì)蛋白中局部親水性(Local hydrophilicity)的計(jì)算發(fā)現(xiàn)，局部平均親水性的峰值區(qū)域大多位于線性B細(xì)胞表位內(nèi)或與之緊密相連，所以親水性峰值區(qū)能在一定程度上預(yù)測(cè)抗原表位。DNAStar中Hydrophilicity plot代表親水區(qū)域，由圖可見(jiàn)V1、V3、V4、V5含有1至3個(gè)不等的親水區(qū)，V2段不含有親水區(qū)。以上預(yù)測(cè)結(jié)果說(shuō)明 V1、V3、V4、V5四段可能含有多個(gè)優(yōu)勢(shì)表位，V2段可能不存在抗原表位。與本研究鑒定結(jié)果一致。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道IBDV VP2抗原表位存在以下幾段:37TLRSETSTYNLTV49，76SNGNYKF82，201D RPRVYTITAADDYQFS217，326SWSARGSLAVTI337，403SERDRLGIKTVW414。均分布于 V1、V3、V4、V5四段中，與本研究鑒定結(jié)果一致。通過(guò)以上比較可以充分證實(shí)本研究所建立的方法的可行性。

雞傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的雞的一種高度接觸性傳染病［11］。VP2是IBDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，主要的宿主保護(hù)性抗原［12］，與中和性抗體的誘導(dǎo)識(shí)別、病毒毒力、細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)，對(duì)于雞傳染性法氏囊病毒VP2蛋白抗原表位的研究比較深入和透徹，其抗原表位圖譜的繪制比較完備、準(zhǔn)確，因此本實(shí)驗(yàn)采用雞傳染性法氏囊病毒VP2蛋白為目標(biāo)蛋白，方便與現(xiàn)有研究成果進(jìn)行比較。

本實(shí)驗(yàn)的目的是證明細(xì)菌展示在分析抗原表位領(lǐng)域中的可行性，探討對(duì)大分子抗原分析的具體方法。進(jìn)一步展望對(duì)抗原進(jìn)行小肽分析的方法，我們可采取利用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切和PCR的方法獲取多個(gè)片段以構(gòu)建多肽庫(kù)，再利用細(xì)菌展示結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)以進(jìn)行抗原的小肽分析。本方法可以優(yōu)先篩選出含有優(yōu)勢(shì)表位的區(qū)域，再將該區(qū)域進(jìn)行分割，最后可以將抗原表位定位至具體的某幾個(gè)氨基酸上。本實(shí)驗(yàn)首次應(yīng)用細(xì)菌展示技術(shù)及流式細(xì)胞術(shù)建立了一種快速、直觀、高通量的抗原表位篩選方法。

［1］ Geysen HM，Meloen RH，Barteling SJ，et al.Use of peptide synthesis to probe viral antigens for epitopes to a resolution of a single amino acid［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1984，7(81):3998-4002.

［2］ Jeme NK.Immunological speculations［J］.Ann Rev Microbiol，1960，14:341-358.

［3］ ，Georgiou G，Hayhurst A，et al.Anchored periplasmic expression，a versatile technology for the isolation of high-affinity anti-bodies from Escherichia coli-expressed libraries［J］.PNAS，2004，101(25):9193-9198.

［4］ Zhou H，Zhang YL，Lu G，et al.Recombinant antibody libraries and selection technologies［J］.New Biotechnology，2011，28(5):448-452.

［5］ Mridula Rani，Meagan Bolles，Donaldson EF，et al.Increased antiblody affinity confers broad in vitro protection against escape mutants of severe acute respiratory syndrome coronavirus［J］.J Virol，2012，86(17):9113-9121.

［6］ 李玉嬌，朱玥潔，楊 晶，等.抗原優(yōu)勢(shì)表位的篩選方法［J］.中國(guó)病原生物學(xué)雜志，2012，7(1):78-80.

［7］ Chen W，Georgiou G.Cell-surface display of heterologous proteins:From high-throughput screening to environmental applications［J］.Biotechnol Bioeng，2002，79(5):496-503.

［8］ Ryutaro Asano，Yukiko Sone，Koki Makale，et al.Humanization of the bispecific epidermal growth factor receptor CD3 diabody and its efficacy as a potential clinical reagent［J］.Clin Cancer Res，2006，12(13):4036-4042.

［9］ Geortiou G，Stathopoulos C，Daugherty PS，et al.Display of heterologous proteins on the surface of microorganisms:from the screening of combinatorial libraries to live recombinant vaccines［J］.Nat Biotechnol，1997，15(1):29-34.

［10］ Hopp TP，Woods KR.Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences［J］.Proc Natl Acad Sci，1981，78(6):3824-3828.

［11］ 祁小樂(lè)，王笑梅，高玉龍，等.雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白研究進(jìn)展［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，30(8):656-660.

［12］ 宇文延青，師學(xué)珍.傳染性法氏囊病病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白研究進(jìn)展［J］.畜牧與獸醫(yī)，2008，41(12):100-103.