核轉(zhuǎn)錄因子、c MY C在彌漫大B細胞淋巴瘤亞型中的表達及意義

肖建波 劉衛(wèi)東 李海麗 王軼楠 馬守東 趙 郁 王鈞 劉金慧

河北省唐山市人民醫(yī)院放化療科，河北 唐山 063000

彌漫大B細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphomas，DLBCL）是非霍奇金淋巴 瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）中最常見的一種亞型，占NHL的30%～40%，是一種異質(zhì)性很強的疾病，在臨床表現(xiàn)、組織形態(tài)和預后等多方面都具有很大差異。因此Alizadeh等[1]根據(jù)基因表達譜不同，將DLBCL分為生發(fā)中心型（germinal center B-cell-like，GCB）和活化 B 細胞型（activated B-cell-like，ABC）。 但由于受技術(shù)條件的限制，基因芯片技術(shù)尚無法在臨床中普遍應用。2004年Hans等[2]應用免疫組化的方法，通過檢測淋巴瘤組織中CD10、BCL6和MUM1的表達情況進行分型，分為生發(fā)中心型（GCB）和非生發(fā)中心型（non-GCB，ABC）兩個亞型。該免疫組化分型與基因芯片的分型結(jié)果具有較高的符合率，其中GCB型為71%，非GCB型為88%。在2008年WHO造血和淋巴組織腫瘤分類方案中，建議可用免疫組化方法對DLBCL進行分型。近年研究發(fā)現(xiàn)，DLBCL的兩種亞型在預后上有很大差別，這與兩種亞型的細胞遺傳學不同有關，臨床表現(xiàn)在蛋白表達不同。其中核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear transcription factor κB，NF-κB） 及原癌基因 cMYC 在 DLBCL 淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，本研究擬探討NF-κB p65、cMYC在DLBCL不同亞型之間的表達情況及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究對象 收集57例唐山市人民院2008年1月～2012年5月收治的DLBCL患者淋巴結(jié)組織蠟塊，全部重新復查淋巴結(jié)蠟塊材料良好，同時上述患者均經(jīng)HE及免疫組織化方法確診。通過免疫組織化學方法檢測CD10、BCL6和MUM1表達情況，若 CD10和（或）BCL6（+）判定為 GCB 型，若 MUM1（+）判定為ABC型。

1.1.2 病歷資料 57例患者中，男29例，女28例，年齡 17～72 歲，平均年齡（45±6）歲；國際預后指數(shù)（intemational pmgnostic index，IPI）評分 0～2 分 31 例，3～5分26例；臨床分期Ⅰ、Ⅱ期23例，Ⅲ、Ⅳ期34例；GCB型24例，ABC型33例。本組病例隨訪時間8～42 個月，平均（23±2）個月。

1.2 免疫組化方法及陽性結(jié)果判定

患者淋巴結(jié)組織蠟塊標本經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm厚切片，切片常規(guī)脫蠟水化；0.3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，10%小牛血清封閉切片，滴加一抗，4℃過夜。PBS洗后滴加廣譜生物素化二抗（1∶200），SP 復合物（1∶200），DAB顯色，蘇木精復染胞核，脫水，透明，封片。分別設相應的陽性、陰性、空白對照。NF-κB p65及cMYC的主要陽性染色部位在細胞核和細胞漿。NF-κB p65及cMYC陽性表達為棕黃色或棕褐色細小顆粒。用已知陽性片為陽性對照，所有病理標本切片用PBS液代替一抗作陰性對照。陽性反應為細胞漿內(nèi)或細胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒。陽性反應為細胞漿內(nèi)或細胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒，陽性反應細胞>10%為陽性結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，采用t檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。生存分析采用Kaplan-Meier生存分析和Log Rank檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 NF-κB p65、cMYC在 DLBCL組織中的蛋白表達情況

57例 DLBCL患者中 34例表達 NF-κB p65占59.6%。24例GCB亞型中，10例表達NF-κB p65占41.7%。33例ABC亞型，24例表達NF-κB p65占分別為72.7%。NF-κB p65在ABC亞型中的表達明顯高于 GCB亞型，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.569，P=0.029）。31例表達cMYC占54.4%。24例GCB亞型中，9例表達 cMYC占 37.5%，33例 ABC亞型，22例表達了cMYC占66.7%。cMYC在ABC亞型中的表達明顯高于 GCB 亞型，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.765，P=0.035）。見表1。

表1 NF-κB p65、cMYC陽性表達與臨床特征的關系（例）

2.2 NF-κB p65、cMYC在 DLBCL組織中的蛋白表達與臨床特征的關系

57例DLBCL組織NF-κB p65的表達在不同年齡（≤60 歲、>60 歲）、性別（男、女）、分期（Ⅰ、Ⅱ期和Ⅲ、Ⅳ期）及不同乳酸脫氫酶（LDH）（正常、升高）組間表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。NF-κB p65在IPI 0～2分組陽性表達率為41.94%，3～5分組陽性表達率為 80.77%，表達差異有統(tǒng)計學意義（χ2=8.860，P=0.003）；NF-κB p65在ABC及GCB亞型組織中的陽性表達率分別為72.7%、41.6%，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.569，P=0.029）。IPI是影響DLBCL預后的獨立危險因素，ABC及GCB兩種亞型淋巴瘤預后不同，而NF-κB p65在不同IPI及病理亞型組間表達均不同，提示NF-κB p65很可能與預后有關。cMYC的表達在不同年齡（≤60 歲、>60 歲）、性別（男、女）、分期（Ⅰ、Ⅱ期和Ⅲ、Ⅳ期）、LDH（正常、升高）及IPI組間表達差異無統(tǒng)計學意義。在ABC及GCBL亞型組織中的陽性表達率分別為66.7%、54.4%，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.765，P=0.035）。兩種病理亞型預后不同，進而推測cMYC的表達很可能與預后相關。見表1。

2.3 Kaplan-Meier生存分析

全部 DLBCL及 GCB亞型患者，NF-κB p65和（或）cMYC的陽性/陰性表達，患者的生存曲線差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），提示 NF-κB p65及 cMYC 的表達與DLBCL及GCB亞型患者生存不相關。在ABC亞型中，NF-κB p65陽性表達組生存率低于陰性表達組（P=0.043）（圖1）。cMYC陽性表達組生存率低于陰性表達組（P=0.024）（圖 2）。 提示 NF-κB p65 或cMYC的蛋白表達可能是影響ABC亞型預后的重要不利因素。

圖1 33例ABC亞型患者NF-κB p65+/-表達組的生存曲線

3 討論

DLBCL是常見的NHL之一，盡管美羅華為基礎的化療方案在DLBCL中取得了很大成功，然而高?；颊叩念A后仍然較差，尤其是在ABC亞型治療效果不佳。在臨床工作中，識別特殊患者進行規(guī)范的分層治療，成為一個亟待解決的問題。

目前，IPI是公認的DLBCL的獨立不良預后因素，IPI為3～5分患者預后明顯差于0～2分患者，許多學者提出以此進行分層治療，最近有文獻報道NF-κB與IPI同為DLBCL的獨立不良預后因素，NF-κB陽性表達預后差[3]。NF-κB是廣泛存在于真核生物細胞內(nèi)的一種可誘導的轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白，與淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。董佑紅等[4]報道DLBCL患者組織中NF-κB的表達與IPI評分相關，本研究也發(fā)現(xiàn)了NF-κB在DLBCL組織中表達，NF-κB p65的表達率為59.6%，并且高IPI評分組NF-κB p65陽性表達率高，與報道相似，近而推測 NF-κB表達很可能是影響DLBCL的一個不利因素。

圖2 33例ABC亞型患者cMYC+/-表達組的生存曲線

研究發(fā)現(xiàn)NF-κB在DLBCL的不同亞型中，表達的臨床意義不同，與ABC亞型預后不良有關[5]。Davis等[6]應用IκBα的特異性抑制劑阻斷NF-κB通路后發(fā)現(xiàn)ABC亞型組的細胞出現(xiàn)快速的凋亡，而GCB亞型組細胞不受影響，提示NF-κB活化與ABC亞型DLBCL的增殖有關。孟偉等[7]報道NF-κB在ABC亞型中表達高于GCB型。NF-κB在ABC亞型DLBCL中的意義可能不同于GCB亞型。本研究NF-κB p65在ABC、GCB亞型組的表達率分別為 72.7%、41.6%，ABC亞型表達率明顯高于GCB亞型。生存分析發(fā)現(xiàn)，在ABC亞型DLBCL中，NF-κB p65陽性與陰性表達組的生存曲線明顯不同，陽性組生存率低于陰性表組，差異有統(tǒng)計學意義。但在GCB亞型中，本研究并未觀察到類似現(xiàn)象，提示NF-κB p65很可能是ABC亞型DLBCL的不利預后因素。

MYC基因是位于8q24的原癌基因，對細胞增殖、生長、分化、凋亡及促進新生血管形成等方面發(fā)揮重要作用[8]。許多國內(nèi)外研究表明cMYC基因異常與NHL的不良預后相關，MYC重排是獨立于IPI的不良預后因子[6-9]。cMYC基因異常與DLBCL預后密切相關，可作為預測DLBCL的預后因素并指導治療[9]。MYC基因重排是Burkitt淋巴瘤的特征，也發(fā)生在5%～10%的DLBCL患者中。近年來發(fā)現(xiàn)DLBCL患者的一個重要的危險因素是MYC易位，特別是它與BCL-2易位相連接時，預后極差。Johnson等[10]和Shimin等[11]研究發(fā)現(xiàn)，MYC蛋白在DLBCL的兩種亞型中均有表達，當它與BCL-2共同表達時預后不佳，對標準的R-CHOP方案治療效果差，MYC蛋白的高表達與易位相關。在DLBCL患者中，常有cMYC蛋白過表達的現(xiàn)象，Mossafa等[12]發(fā)現(xiàn)DLBCL患者中出現(xiàn)cMYC基因擴增，并且這些患者的預后較差。本研究也發(fā)現(xiàn)了cMYC在DLBCL中的表達，在ABC及GCB亞型中的表達率分別為66.7%、54.4%，差異有統(tǒng)計學意義。生存分析顯示，在ABC亞型DLBCL中，cMYC表達陽性組與陰性組的生存曲線明顯不同，陽性組生存率低于陰性組，差異有統(tǒng)計學意義。但在全部DLBCL及GCB亞型組并未觀察到類似現(xiàn)象。MYC的負性預后作用在與BCL-2共表達患者中明顯[10]，MYC基因擴增與BCL-2基因擴增正相關，均為ABC型顯著高于GCB型[13]，BCL-2是 NF-κB的重要靶基因，在 ABC亞型中，常伴隨NF-κB、BCL-2的過表達，由此推測在ABC亞型，cMYC的負性預后作用可能與 NF-κB、BCL-2的表達有關，但仍需進一步研究證實。

本研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB p65和cMYC在ABC亞型的表達率均高于GCB亞型，在ABC亞型，它們的陽性表達均與預后差相關，它們的臨床意義有相似之處。既往研究發(fā)現(xiàn)ABC亞型DLBCL，許多基因上調(diào)，如MYC、BCL-2、cyclinD2 等，Lim 等[14]研究發(fā)現(xiàn)這些基因的上調(diào)可能與NF-κB在ABC亞型中不斷激活有關。由此本研究推測NF-κB p65和cMYC可能在ABC亞型的發(fā)生、發(fā)展過程中存在一定聯(lián)系，但其機制仍不清楚，需待進一步研究探討。在ABC亞型，NF-κB p65、cMYC的表達與生存密切相關，有可能成為ABC亞型新的預后指標，需在臨床工作中進一步研究證實。

[1]Alizadeh AA，Eisen MB，Davis RE，et al.Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling[J].Nature，2000，403（6769）：503-511.

[2]Hans CP，Weisenburger DD，Greiner TC，et al.Confirmation of the molecular classification of diffuse large B-cell lymphoma by immunohistochemistry using a tissue microarray[J].Blood，2004，103（1）：275-282.

[3]Bavi P，Uddin S，Bu R，et al.The biological and clinical impact of inhibition of NF-κB-initiated apoptosis in diffuse large B cell lymphoma（DLBCL） [J].J Pathol，2011，224（3）：355-366.

[4]董佑紅，伍鋼，王濤，等.NF-κBp50和VEGF在彌漫性大B細胞淋巴瘤組織中的表達及其臨床意義[J].中華腫瘤防治雜志，2007，14（6）：436-439.

[5]王艷君，孟丹.bcl-2與NF-κB/p65在彌漫性大B細胞淋巴瘤不同亞型中表達的意義[J].白血病·淋巴瘤，2009，18（10）：592-595

[6]Davis RE，Brown KD，Benlish U，et al.Constitutive nuclear factor-κB activity is required for survival of activated B-cell diffuse large B-cell lymphoma cells[J].J Exp Med，2001，194：1861-1874.

[7]孟偉，石雨薇，顧霞.PKC-βⅡ、NF-κBp50在彌漫性大B細胞淋巴瘤中的表達及其意義[J].臨床與實驗病理學雜志，2011，27（1）：56-59.

[8]Kikuchia A，Nakamurab N，Kuze T.Characterization of de novo diffuse large B-cell lymphoma with a translocation of c-myc and immunoglobulin genes[J].Leuk Res，2008，32：1176-1182.

[9]何蘭蘭，嚴峰，劉德亮.bcl-6、p53、c-myc基因異常在彌漫大B細胞淋巴瘤中的臨床意義[J].白血病·淋巴瘤，2013，22（11）：661-664.

[10]Johnson NA，Graham WS， Kerry J.Savage Concurrent Expression of MYC and BCL2 in Diffuse Large B-Cell Lymphoma Treated With Rituximab Plus Cyclophosphamide， Doxorubicin， Vincristine， and Prednisone[J].J Clin Oncol，2012，30：3452-3459.

[11]Shimin H， Zijun YX，Alexander T.MYC/BCL2 protein coexpression contributes to the inferior survival of activated B-cell subtype of diffuse large B-cell lymphoma and demonstrates high-risk gene expression signatures：a report from The International DLBCL Rituximab-CHOP Consortium Program[J].Blood，2013，121：4021-4031.

[12]Mossafa H，Damotte D，Jenabian A， et al.Non-Hodgkin＇s lymphomas with Burkitt－like cells are associated with C-myc amplification and poor prognosis[J].Leuk Lymphoma，2006，47：1885-1893.

[13]梁艷，潘毅，房愛菊.彌漫性大B細胞淋巴瘤C-MYC基因異常分析[J].中國腫瘤臨床，2013，40（9）：513-516.

[14]Lim KH，Yang Y，Staudt LM.Pathogenetic importance and therapeutic implications of NF-κB in lymphoid malignancies[J].Immunol Rev，2012，246（1）：359-378.