八肽膽囊收縮素及其受體拮抗劑對(duì)嗎啡戒斷大鼠腦內(nèi)［Ca2+］i和CaM活性的影響

張雅靜，馬興友，文 迪，楊勝昌，于 峰，董 玫，馬春玲，叢 斌

(1.河北醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)系，河北省法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊 050017;2.石家莊市第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河北石家莊 050011;3.邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校第二附屬醫(yī)院，河北邢臺(tái) 054000)

八肽膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK-8)是廣泛存在于中樞和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)的一種神經(jīng)肽，其通過(guò)CCK1及CCK2兩種不同的受體亞型參與調(diào)節(jié)疼痛、焦慮、學(xué)習(xí)和記憶等過(guò)程。我室前期研究發(fā)現(xiàn)CCK-8對(duì)阿片成癮過(guò)程具有明顯的調(diào)節(jié)作用［1］。Ca2+-CaM-CaMK是藥物成癮過(guò)程中除AC-PKA之外另一條重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在嗎啡依賴(lài)和戒斷過(guò)程中起著重要作用［2］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立嗎啡戒斷大鼠模型，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠皮質(zhì)、海馬和紋狀體內(nèi)［Ca2+］i和CaM活性，探討CCK-8及其受體拮抗劑參與調(diào)節(jié)嗎啡依賴(lài)及戒斷過(guò)程的細(xì)胞信號(hào)機(jī)制，為CCK-8在戒毒方面的應(yīng)用提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 鹽酸嗎啡(morphine hydrochloride，Mor)為沈陽(yáng)第一制藥廠(chǎng)產(chǎn)品;CCK-8、納洛酮(naloxone，Nal)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，CCK1受體拮抗(L-364，718)和 CCK2受體拮抗劑(LY-288，513)購(gòu)自英國(guó)Tocris公司，三氟拉嗪(TFP)購(gòu)自瑞士A-lexis公司，F(xiàn)luo3-AM和F-127購(gòu)自DOJINDO公司;FACS Calibur型流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。

1.2 動(dòng)物分組及給藥方式 清潔級(jí)健康♂ Wistar大鼠42只，體質(zhì)量190～210 g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng) 1周，室溫 (22±1)℃，濕度50%，自然晝夜循環(huán)非直接光照條件生活，通風(fēng)良好，自由攝食、飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，參照文獻(xiàn)建立大鼠慢性嗎啡依賴(lài)及急性催促戒斷模型:以劑量遞增法連續(xù)皮下注射嗎啡 (10、20、30、40、50 mg·kg－1)5 d，每天 2 次，間隔12 h(8 ∶00、20∶00)，記錄每日大鼠體重變化。d 6，8∶00皮下注射嗎啡50 mg·kg－1，2 h后腹腔注射鹽酸納絡(luò)酮(5 mg·kg－1)進(jìn)行催促戒斷，記錄戒斷后15 min大鼠跳躍次數(shù)及1 h后體重變化。然后用改良Gellert-Holtzman法評(píng)價(jià)模型建立是否成功，剔除未成模動(dòng)物。具體分組如下，①鹽水對(duì)照組(Control):背部皮下注射同等劑量的生理鹽水;②嗎啡依賴(lài)組(Mor):按照上述方案進(jìn)行嗎啡皮下注射;③戒斷組(Nal):按照上述方案嗎啡皮下注射后2 h進(jìn)行納絡(luò)酮催促戒斷;④－⑥慢性藥物干預(yù)組(CCK-8/L-364，718/LY-288，513):給予嗎啡前 30 min 分別腹腔注射 CCK-8(50 μg·kg－1)，L-364，718(1 mg·kg－1)，LY-288，513(1 mg·kg－1)，余同③;⑦溶劑對(duì)照組(Vehicle):給予嗎啡前30 min，注射同等體積的溶劑 (DMSO ∶1，3-丙二醇 =1 ∶4，1 ml·kg－1)，余同③。

1.3 大鼠神經(jīng)細(xì)胞的急性分離 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠行斷頭術(shù)，取腦放入定位模具內(nèi)，參照大鼠腦立體定位圖譜 (Paxinos and Watson，1998)，冰浴下分離額葉皮質(zhì)、海馬和紋狀體，立即置于4℃預(yù)冷的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。參照文獻(xiàn)制備單細(xì)胞懸液，方法如下:剔除軟腦膜和血管，用無(wú)鈣鎂Hanks液清洗后，將組織充分剪碎，研磨，過(guò)200目篩網(wǎng)，再過(guò)400目篩網(wǎng)去除團(tuán)塊，將濾液離心(4℃，1 000 r·min－1，10 min)，收集沉淀，用 Hanks液洗滌1次，最后調(diào)整細(xì)胞濃度到1 ×1010～2×1010個(gè)·L－1，用臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞活性，細(xì)胞活性大于90%可用于［Ca2+］i及CaM活性的測(cè)定。

1.4 細(xì)胞內(nèi) ［Ca2+］i的測(cè)定 取400 μl上述細(xì)胞懸液，加入2 μl Fluo-3 AM(終濃度 5 μmol·L－1)和2 μl F-127(終濃度 0.05%)，于 37℃ 恒溫箱中負(fù)載30～40 min，負(fù)載后的細(xì)胞用無(wú)鈣鎂液Hanks洗滌2次。每份標(biāo)本用流式細(xì)胞儀測(cè)定10 000個(gè)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度(average of fluorescent intensity)，以反映［Ca2+］i的變化。

1.5 CaM活性的測(cè)定 取400 μl上述細(xì)胞懸液，加入1 ml預(yù)冷的70%乙醇進(jìn)行固定，4℃ 過(guò)夜。然后用無(wú)鈣PBS洗滌3次，加入1 mmol·L－1三氟拉嗪2 ml振蕩混勻，用250～256 nm紫外光照射20 min。每份標(biāo)本用流式細(xì)胞儀測(cè)定10 000個(gè)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度，用以反映CaM活性的變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS 10.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件處理，以對(duì)照組的平均熒光強(qiáng)度為標(biāo)準(zhǔn)，其余各組與之相比，再次計(jì)算的比值作為統(tǒng)計(jì)值±s，結(jié)果行單因數(shù)的方差分析(ANOVA)，用最小顯著差法(least significant difference，LSD)做兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8及其受體拮抗劑對(duì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i的影響 嗎啡依賴(lài)大鼠在給予納絡(luò)酮催促戒斷后，觀(guān)察到齒顫、濕狗樣抖動(dòng)、腹瀉、流淚、流涎、跳躍、體重明顯下降等戒斷癥狀，說(shuō)明慢性嗎啡依賴(lài)和急性催促戒斷模型建立成功。慢性嗎啡處理后額葉皮質(zhì)、海馬和紋狀體神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i與對(duì)照組比較明顯升高(P＜0.01);納洛酮催促戒斷后，大鼠額葉皮質(zhì)、海馬和紋狀體神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i與嗎啡依賴(lài)組比較均明顯降低(P＜0.01);CCK-8及其受體拮抗劑預(yù)處理使嗎啡戒斷大鼠海馬和紋狀體神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i明顯升高(P＜0.05)，而CCK-8及其受體拮抗劑預(yù)處理對(duì)嗎啡戒斷大鼠額葉皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i無(wú)明顯影響(P＞0.05);溶劑對(duì)照組皮質(zhì)、海馬和紋狀體內(nèi)［Ca2+］i與戒斷組相比差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。見(jiàn)Fig 1，Tab 1。

Fig 1 Effect of CCK-8 and its receptor antagonist on intracellular calcium in prefrontal cortex(PFC)，hippocampus(Hip)and cauduate putamen(CPu)of morphine withdrawal rats(±s，n=6)

Tab 1 Effect of CCK-8 and its receptor antagonists on intracellular calcium in cortex，hippocampus and caudate putamen of morphine withdrawal rats(±s，n=6)

Tab 1 Effect of CCK-8 and its receptor antagonists on intracellular calcium in cortex，hippocampus and caudate putamen of morphine withdrawal rats(±s，n=6)

＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs Mor;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs Nal.

Group ［Ca2+］i /%of control PFC Hip CPu Control 1±0 1±0 1±0 Mor 1.282 ±0.109＊＊ 1.704 ±0.101＊＊ 1.697 ±0.171＊＊Nal 1.103 ±0.120## 1.187 ±0.081## 1.293 ±0.045##Vehicle 1.053 ±0.071 1.232 ±0.099 1.327 ±0.086 CCK-8 1.008 ±0.098 1.139 ±0.031△△ 1.441 ±0.017△L-364，718 1.068 ±0.179 1.286 ±0.136△△ 1.447 ±0.013△LY-288，513 1.090 ±0.149 1.474 ±0.189△△ 1.564 ±0.033△△

2.2 CCK-8及其受體拮抗劑對(duì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi) CaM活性的影響 慢性嗎啡處理使大鼠額葉皮質(zhì)、海馬和紋狀體神經(jīng)細(xì)胞內(nèi) CaM活性明顯增強(qiáng)(P＜0.01);而嗎啡戒斷組大鼠皮質(zhì)、海馬和紋狀體神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)CaM活性與嗎啡依賴(lài)組比較均明顯降低(P＜0.01);CCK-8及其受體拮抗劑預(yù)處理使嗎啡戒斷大鼠海馬和紋狀體神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)CaM活性明顯升高(P＜0.05)，而CCK-8及其受體拮抗劑預(yù)處理對(duì)嗎啡戒斷大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)CaM活性無(wú)明顯影響(P＞0.05);溶劑對(duì)照組皮質(zhì)、海馬和紋狀體內(nèi)CaM活性與戒斷組相比差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。見(jiàn) Fig 2，Tab 2。

Fig 2 Effect of CCK-8 and its receptor antagonists on intracellular calmodulin in cortex，hippocampus and caudate putamen of morphine withdrawal rats(±s，n=6)

Tab 2 Effect of CCK-8 and its receptor antagonist on intracellular calmodulin in cortex，hippocampus and caudate putamen of morphine withdrawal rats(±s，n=6)

Tab 2 Effect of CCK-8 and its receptor antagonist on intracellular calmodulin in cortex，hippocampus and caudate putamen of morphine withdrawal rats(±s，n=6)

＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs Mor;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs Nal.

Group CaM/%of control PFC Hip CPu Control 1±0 1±0 1±0 Mor 1.923 ±0.302＊＊ 1.544 ±0.092＊＊ 1.349 ±0.107＊＊Nal 1.153 ±0.051## 0.696 ±0.008## 0.861 ±0.097##Vehicle 1.027 ±0.004 0.632 ±0.029 0.850 ±0.182 CCK-8 1.639 ±0.117△△ 0.887 ±0.044△△ 2.332 ±0.181△△L-364，718 1.393 ±0.031△ 1.043 ±0.114△△ 1.079 ±0.085△△LY-288，513 2.036 ±0.069△△ 1.323 ±0.082△△ 1.594 ±0.189△△

3 討論

阿片成癮是一種慢性復(fù)發(fā)性腦病，其發(fā)生的確切機(jī)制尚不清楚。最近研究認(rèn)為，許多非阿片受體作用系統(tǒng)可能是阿片依賴(lài)防治中的重要靶點(diǎn)。膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)是一種典型的腦腸肽，并作為神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮著重要作用［3－4］。研究發(fā)現(xiàn)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)源性阿片肽、CCK及其受體重疊分布。CCK-8是目前已知作用最強(qiáng)的內(nèi)源性“抗阿片肽”，其通過(guò)CCK1及CCK2兩種不同的受體亞型在疼痛、學(xué)習(xí)記憶、藥物成癮及情感等方面發(fā)揮多重調(diào)節(jié)作用。以往的研究已證實(shí)了CCK在嗎啡依賴(lài)和戒斷中的抗阿片作用［5］，并且發(fā)現(xiàn)應(yīng)用CCK受體拮抗劑能逆轉(zhuǎn)嗎啡耐受、減輕嗎啡成癮大鼠的急性催促戒斷癥狀［6］。但是，我們的研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)慢性嗎啡作用后中樞CCK受體系統(tǒng)明顯上調(diào)［7］，內(nèi)源性小劑量CCK-8可通過(guò)CCK2受體作為一種內(nèi)源性“抗阿片肽”通過(guò)負(fù)反饋機(jī)制調(diào)節(jié)嗎啡依賴(lài)過(guò)程;而外源性大劑量CCK-8則可通過(guò)激活CCK1受體抑制嗎啡精神依賴(lài)及復(fù)吸過(guò)程［8］，抑制嗎啡條件性位置厭惡［9］，使內(nèi)源性阿片肽原PENK、POMC基因表達(dá)增加［10］。比較發(fā)現(xiàn)，外源性CCK-8的干預(yù)劑量要比內(nèi)源性CCK的劑量高10～1 000倍，我們推斷這種現(xiàn)象與CCK-8的效應(yīng)濃度存在一定關(guān)系，但其具體機(jī)制尚不明確。

Ca2+-CaM-CaMK是嗎啡依賴(lài)和戒斷過(guò)程中一條重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。Ca2+是細(xì)胞內(nèi)普遍存在的第二信使，與效應(yīng)器蛋白的結(jié)合，操縱不同生理學(xué)反應(yīng)指令的發(fā)出，細(xì)胞內(nèi)鈣離子在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的不同方面起樞軸作用。研究表明嗎啡可通過(guò)與其受體結(jié)合而改變NG108-15、SH-SY5Y和星形膠質(zhì)細(xì)胞等神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的 ［Ca2+］i動(dòng)態(tài)平衡［11］。長(zhǎng)期應(yīng)用嗎啡將改變中樞和外周鈣離子通道的數(shù)目和開(kāi)放狀態(tài)。使用阿片類(lèi)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增加可能有兩條途徑:胞外鈣離子內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放鈣離子。王林等［12］采用激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn)嗎啡成癮大鼠相關(guān)核團(tuán)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i明顯升高。鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)是胞內(nèi)一個(gè)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在一定量的［Ca2+］i存在的情況下，CaM從胞質(zhì)的游離狀態(tài)轉(zhuǎn)至結(jié)合狀態(tài)而呈出活性。本實(shí)驗(yàn)顯示，嗎啡依賴(lài)大鼠皮質(zhì)、海馬和紋狀體神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i和 CaM的活性明顯增加;而納洛酮催促戒斷則使Ca2+和CaM活性明顯下降，其結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。溶劑組大鼠皮質(zhì)、紋狀體和海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i和 CaM活性變化同戒斷組相比無(wú)明顯變化，這說(shuō)明每日給予溶劑對(duì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度變化無(wú)影響，從而排除了拮抗劑處理組神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)引起［Ca2+］i和 CaM 活性變化由溶劑引起的可能。

CCK-8干預(yù)可以翻轉(zhuǎn)納洛酮戒斷引起的海馬和紋狀體內(nèi)［Ca2+］i和 CaM活性的降低，但對(duì)皮質(zhì)內(nèi)［Ca2+］i和CaM活性的降低無(wú)明顯影響。該結(jié)果表明，［Ca2+］i和CaM 活性的變化在嗎啡依賴(lài)和戒斷過(guò)程中起著重要的作用，CCK-8可以通過(guò)增加腦內(nèi)［Ca2+］i和CaM的活性等作用達(dá)到緩解部分戒斷癥狀的作用。其機(jī)制可能是(1)CCK-8通過(guò)激活胞內(nèi)第二信使 IP3而引起細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放，從而使［Ca2+］i的增加。(2)CCK-8也可能是通過(guò)激活DAG-PKC途徑，加速細(xì)胞外鈣的內(nèi)流，從而使［Ca2+］i增加。不同腦區(qū)在嗎啡成癮過(guò)程中的作用不同，CCK-8其在不同部位可能發(fā)揮不同的作用，從而表現(xiàn)出CCK-8作用的腦區(qū)特異性。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)不同濃度的CCK-8可分別通過(guò)激活CCK1/2受體在嗎啡依賴(lài)過(guò)程中發(fā)揮不同作用。由于細(xì)胞表面兩種受體亞型(CCK1R和CCK2R)的敏感度及其偶聯(lián)Gs/i蛋白的功能不一致，并且 CCK2受體還可能通過(guò)Gs或Gi蛋白以及不同的信號(hào)通路介導(dǎo)多種生物學(xué)功能?？偨Y(jié)本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，CCK及其受體拮抗劑翻轉(zhuǎn)納洛酮催促戒斷引起［Ca2+］i和CaM活性的降低，可能是其對(duì)抗嗎啡成癮的機(jī)制之一。不同劑量的CCK-8對(duì)嗎啡成癮動(dòng)物的影響及其受體及受體后信號(hào)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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