響應(yīng)面優(yōu)化超聲波提取桑葚酒渣總黃酮的工藝

（韓山師范學(xué)院生物學(xué)系，廣東潮州 521041）

桑葚又叫桑果、桑棗，味甜多汁、風(fēng)味獨特、富含營養(yǎng)，具有增強免疫，促進造血細胞生長，抗誘變，抗衰老，降血糖，降血脂和護肝等多種藥理作用，于1993年被衛(wèi)生部列為既是食品又是藥品的水果，屬于衛(wèi)生部規(guī)定的開發(fā)功能食品的原料[1-3]。黃酮是一類廣泛存在于植物中的多酚類物質(zhì)，是植物在自然選擇過程中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，對植物的生長、發(fā)育、開花、結(jié)果、抵御異物的侵襲起著重要作用。研究表明，黃酮在動物體內(nèi)表現(xiàn)出廣泛的生物活性，不僅具有抗癌、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、抗過敏以及抑制脂質(zhì)過氧化作用，還具有抑制血小板凝集和改善毛細管的滲透性及脆性的生理功能[4-5]。超聲波輔助提取法提取黃酮是目前較新的提取方法，是利用超聲波的空化作用破壞植物細胞和細胞膜結(jié)構(gòu)，從而加強黃酮類物質(zhì)的釋放與溶出，超聲波使提取液不斷震蕩，有助于溶劑的滲入與溶質(zhì)的擴散，顯著提高了桑葚酒渣總黃酮的提取率[6]。本實驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對桑葚酒渣中總黃酮的提取工藝條件進行優(yōu)化，為桑葚酒渣中總黃酮超聲波輔助提取提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葚酒渣：將購于潮州楓春水果批發(fā)市場的桑葚進行果酒發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后用雙層紗布將酒渣壓榨過濾，將濾渣在60℃條件下真空干燥6 h，并用粉碎機粉碎，過30目篩，得預(yù)處理后的桑葚酒渣，冷藏備用。

95%食用酒精、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉：汕頭西隴化工有限公司；蘆?。ㄉ噭簢宜幤飞镏破窓z定所制；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；超聲波清洗器SB5200TDT：寧波新芝生物科技股份有限公司；電子分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；YK-12風(fēng)速中藥粉碎機：山東省青州市益康中藥機械有限公司；離心機：湖南湘儀有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蘆丁濃度及吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線制作[7-8]

精密稱取經(jīng)120℃干燥至恒重蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，用50%乙醇溶解，搖勻并定容至50 mL，配制為0.1 g/L蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，作為貯備液備用。分別取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于 25 mL 容量瓶中，用50%乙醇稀釋至10 mL，加入5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，再加入10%Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，再加入1mol/L NaOH溶液2 mL，用50%乙醇定容，混合后搖勻，放置15 min，以試劑空白為參比，于510 nm處測吸光度值。以吸光度A為縱坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=8.002 4C-0.000 8，R2=0.999 7。

1.3.2 超聲波工藝流程及總黃酮提取率測定

準(zhǔn)確稱取1.000 g的桑葚酒渣粉于250 mL錐形瓶中，加入一定體積的乙醇溶液搖勻，用保鮮膜將瓶口封住后浸泡3 h，然后采用超聲波提取一定時間，抽濾，濾液用50%乙醇定容至100 mL，作為待測液。準(zhǔn)確吸待測液1 mL于25 mL的容量瓶中，照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測定吸光度，計算樣品總黃酮的提取率。

1.3.3 單因素試驗

以原料總黃酮提取率為測定指標(biāo)，選用不同濃度的乙醇溶液、提取溫度、料液比、超聲波功率及提取時間作為影響因素，在保持其他因素不變的條件下進行單因素試驗，考察各因素對原料總黃酮提取率的影響，篩選最佳提取工藝。

1.3.4 響應(yīng)曲面試驗[9-10]

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，在單因素試驗基礎(chǔ)上采用5因素3水平響相應(yīng)面法分析桑葚酒渣總黃酮提取條件，試驗設(shè)計因素及水平見表1。

1.3.5 統(tǒng)計分析[9]

二次多項式回歸分析和方差分析由Design Expert 7.0軟件完成。

表1 桑葚酒渣總黃酮響應(yīng)面試驗設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and levels tested in response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇濃度對桑葚總黃酮提取率的影響

分別采用濃度為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇為提取溶劑，在提取溫度60℃、料液比1∶30（g/mL）、超聲波功率350 W、提取時間80 min的條件下用超聲波輔助法提取桑椹酒渣總黃酮，考察乙醇濃度對桑葚總黃酮提取率的影響。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對桑葚酒渣總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction rate of total flavonoids

由圖1可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)對桑椹酒渣總黃酮的提取率有顯著影響，乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，可引起細胞的結(jié)構(gòu)變化，脂溶性黃酮類化合物的溶解性也增大，有利于黃酮的提取，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時提取率達到最高點，而后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，總黃酮提取率降低。因此乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時總黃酮的提取率最佳。

2.1.2 超聲溫度對總黃酮提取率的影響

以70%乙醇為提取溶劑，在料液比1∶30（g/mL），超聲波功率350 W，提取時間為80 min，提取溫度分別設(shè)置為 40、50、60、70、80、90 ℃，考察超聲溫度對桑椹酒渣總黃酮提取率的影響。由圖2可知，在超聲溫度低于70℃時，隨著溫度的升高，總黃酮的提取率有顯著提高，溫度高于70℃后，隨著溫度的升高總黃酮提取率趨于下降。這是因為在較低溫度下，物質(zhì)分子熱能較低，不利于活性物質(zhì)溶出；當(dāng)溫度過高時，一些熱敏性組分被破壞，另外高溫條件下超聲振動也破壞活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致總黃酮提取率下降，因而超聲溫度應(yīng)選擇70℃最佳[11-12]。

圖2 超聲溫度對桑葚酒渣總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic extraction temperature on extraction rate of total flavonoids

2.1.3 料液比對總黃酮得率的影響

以70%乙醇為提取溶劑，在提取溫度70℃、超聲波功率350 W、提取時間80 min的條件下，分別采用料液比為 1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35（g/mL），考察料液比對桑椹酒渣總黃酮提取率的影響。

圖3 料液比對桑葚酒渣總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of material-to-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids

由圖3可知，料液比對桑椹酒渣總黃酮提取率有影響，當(dāng)料液比小于1∶30（g/mL）時，提取率隨著料液比的增加而增加。由于有效成分濃度梯度增大，擴散速率提高，有利于提取率的提高，當(dāng)料液比超過1∶30（g/mL）后提取率開始下降，而且料液比的增加將會加大后期濃縮的時間和能耗，所以選擇料液比1 ∶30（g/mL）最佳。

2.1.4 超聲功率對總黃酮得率的影響

以70%乙醇為提取溶劑，在提取溫度70℃、料液比 1∶30（g/mL）、超聲時間 80 min的條件下，分別采用超聲波功率為 200、250、300、350、400 W，考察超聲波功率對桑椹酒渣總黃酮提取率的影響。由圖4可知，在200 W～350 W之間，隨著超聲功率的增大，總黃酮的提取率也逐漸增加，當(dāng)超聲功率達到350 W之后，總黃酮提取率開始下降，而且繼續(xù)增加超聲功率也會增加能源的消耗。因此，超聲功率選擇350 W為宜[13]。

2.1.5 超聲時間對總黃酮得率的影響

以70%乙醇為提取溶劑，在超聲溫度70℃、料液比1∶30（g/mL）、超聲波功率350 W的條件下，分別提取 20、40、60、80、100 min，考察超聲時間對桑椹酒渣總黃酮提取率的影響。

圖4 超聲波功率對桑葚酒渣總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasomic power on extraction rate of total flavonoids

圖5 超聲時間對桑葚酒渣總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic extraction time on extraction rate of total flavonoids

由圖5可知，在超聲時間為20 min～80 min之間，隨著提取時間的增大，總黃酮的提取率也逐漸增加，當(dāng)提取達到80 min之后，總黃酮提取率增加幅度不大，繼續(xù)增加提取時間反而會降低總黃酮的溶出。因此，超聲時間選擇80 min為宜。

2.2 方差分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

以乙醇濃度（A）、超聲溫度（B）、料液比（C）、超聲波功率（D）、超聲時間（E）為自變量，以桑葚酒渣總黃酮提取率（Y）為響應(yīng)值進行設(shè)計試驗，響應(yīng)面試驗結(jié)果見表2。

表2 超聲波輔助提取桑葚酒渣總黃酮工藝響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for surface analysis

續(xù)表2 超聲波輔助提取桑葚酒渣總黃酮工藝響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Continue table 2 Experimental design and results for surface analysis

2.2.2 二次相應(yīng)面回歸模型的建立與方差分析

采用Design-Expert 7.0軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合分析。為了得到更精簡的模型，對模型分析中二次項影響不顯著的項進行剔除，然后再進行方差分析，得到響應(yīng)面試驗結(jié)果的精簡模型方差分析見表3。

從表3可以看出，AC、BC、A2、B2、C2、D2、E2對響應(yīng)值影響顯著，說明乙醇濃度和料液比，溫度和料液比分別有交互作用，說明乙醇濃度、溫度、料液比是總黃酮提取過程中的關(guān)鍵控制因素。失擬項p=0.075 2沒有顯著性意義，說明數(shù)據(jù)中沒有異常點，不需要引入更高次數(shù)的項，模型適當(dāng)。該決定系數(shù)R2=0.985 6，表明該模型的擬合度好，建模成功。

表3 精簡模型方差分析及顯著性檢驗結(jié)果Table 3 ANOVA for the simple developed regression mode

根據(jù)精簡模型可建立回歸方程為：

Y=5.11-0.014A-0.012B+0.018C+0.003125D-0.014E-0.048AC-0.038BC-0.41A2-0.39B2-0.38C2-0.40D2-0.41E2

2.2.3 響應(yīng)面分析

為了更直觀的表現(xiàn)兩個因素同時對總黃酮提取率的影響，可以令其他因素水平值為零，僅考慮這3個因素水平價值為零，即進行降維分析，得到的二元二次方程可以繪出相應(yīng)的響應(yīng)面圖和等高圖，由圖6可知，響應(yīng)面開口向下，隨著每個因素的增大，響應(yīng)值增大，當(dāng)響應(yīng)值增大到極值后，隨著因素的增大，響應(yīng)值逐漸減小，該模型有穩(wěn)定點，且穩(wěn)定點是最大值。

2.2.4 模型確認及驗證試驗

通過Design-expert編程得到的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度 75%，溫度69.95℃，料液比1∶29.8（g/mL），超聲功率350 W，超聲提取時間79.2 min，理論預(yù)測值總黃酮得率為4.68%。值得注意的是表2中的試驗41～46的提取率較理論值（4.68%）大，原因是響應(yīng)面模型是大樣本統(tǒng)計值，而試驗41～46得出的只是單一試驗值，從統(tǒng)計學(xué)意義上來講不具代表性[14-15]。

參照理論上的最佳提取工藝條件，并根據(jù)實際情況進行調(diào)整：乙醇濃度75%，溫度70℃，料液比1∶29 g/mL，超聲功率350 W，超聲提取時間79 min，進行3次平行驗證試驗，所得試驗結(jié)果平均值為4.71%。實測值與理論值極為接近。

圖6 各兩因素交互作用對桑葚酒渣總黃酮提取率影響的相應(yīng)面及等高線Fig.6 Response surface and contour plots showing the effects of pairwise interactions various process conditions on extraction rate of flavonoids

3 結(jié)論

根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，利用Design-Expert 7.0.1軟件，優(yōu)化后得到的預(yù)測結(jié)果與實驗結(jié)果較吻合。優(yōu)化后得到提取桑葚酒渣總黃酮的最佳工藝參數(shù)為：乙醇濃度75%，提取溫度70℃，料液比1∶29（g/mL），超聲波功率350 W，提取時間79 min，在此條件下，桑葚酒渣總黃酮的提取率為4.71%。通過本試驗可獲得桑葚酒渣總黃酮的優(yōu)化提取工藝條件，為桑葚酒渣中總黃酮超聲波輔助提取提供了理論依據(jù)。

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