大豆乳清蛋白提取工藝的研究

（河南城建學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，河南平頂山 467036）

蛋白質(zhì)是人們?nèi)粘Ｉ钪斜匦璧闹匾獱I養(yǎng)物質(zhì)，而大豆是目前蛋白含量最為豐富的一種（蛋白質(zhì)含量在40%以上）植物，大豆蛋白中含有人體必需的8種氨基酸，特別是大豆中賴氨酸、亮氨酸、蘇氨酸含量較高，對人體有很高的利用價值。大豆蛋白制品包括大豆蛋白粉、濃縮大豆蛋白、大豆分離蛋白等，大豆分離蛋白含量在90%以上，被廣泛用來加工豆制產(chǎn)品[1]。目前以提取大豆分離蛋白為目的的大豆深加工企業(yè)每天都要排放大量的乳清廢水。在典型的堿溶酸沉工藝中，每生產(chǎn)1 t大豆分離蛋白會排放30 m2～50 m2的乳清廢水[2]，其中大部分直接排入了自然水體，造成了嚴重的資源浪費和環(huán)境污染[3-5]。由于乳清蛋白具有很好的酸溶解性和優(yōu)越的乳化性和起泡性，長期食用還具有抗腫瘤效果及增強免疫作用，因此在食品加工中有廣泛的應(yīng)用前景[6-7]。為了更好地開發(fā)和回收利用大豆乳清廢水中的乳清蛋白，本文以生產(chǎn)大豆分離蛋白產(chǎn)生的大豆乳清廢水為原料，對大豆乳清蛋白的提取工藝進行了詳細的描述。采用殼聚糖作為絮凝劑將大豆乳清蛋白沉降，得到的大豆乳清蛋白-殼聚糖復(fù)合物用水溶解離心后可除去殼聚糖，得到可溶性大豆乳清蛋白?；厥沾蠖箯U水中的乳清蛋白不僅節(jié)約資源，生產(chǎn)附加值產(chǎn)品，而且有效的控制了污染，對延長大豆產(chǎn)業(yè)鏈、推動大豆產(chǎn)業(yè)發(fā)展、有效控制污染具有重要的意義[8]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

大豆乳清廢水：平頂山市天晶植物蛋白有限公司；牛血清蛋白，考馬斯亮藍：北京索萊寶科技有限公司；溴酚藍：北京中生瑞泰科技有限公司；無水氯化鈣：分析純，濰坊祥坤化工有限公司；殼聚糖：上海鶴善實業(yè)有限責(zé)任公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

循環(huán)水式多用真空泵（SHB-III）：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；低速離心機（KDC-1044）：科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；pH計（pHSJ-3SJ）：上海精密科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋（HWS28）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；紫外可見分光光度計（T6）：北京普希通用通用儀器有限責(zé)任公司；冷凍干燥機（AIpHAl-2LD）：德國 Christ。

1.2 方法

1.2.1 實驗流程

大豆廢液→離心→真空抽濾泵抽濾→CaCl2預(yù)處理→離心→殼聚糖處理→離心→除鹽→冷凍干燥→大豆乳清蛋白粉

1.2.3 蛋白質(zhì)含量檢測

根據(jù)文獻[9] ，操作步驟如下。

1）蛋白質(zhì)標準曲線測定：分別取 0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL 的 1 mg/mL 牛血清蛋白標準溶液于試管中，再加蒸餾水至0.10 mL，然后取5 mL考馬斯亮藍試劑于試管中，搖勻，并在2 min～5 min內(nèi)，測其595 nm下的光吸收值，以標準牛血清蛋白的濃度為橫坐標，以對應(yīng)的595 nm下的光吸收值為縱坐標，繪制標準曲線。

2）取0.10 mL乳清廢液于試管中，然后取5 mL考馬斯亮藍試劑于試管中搖勻，在2 min～5 min內(nèi)，測其595 nm下的光吸收值，同時做2個平行組?？瞻讓φ沼谜麴s水代替廢液。最后將測得的光吸收值代入標準曲線，換算出蛋白含量。

1.2.4 大豆乳清廢液的預(yù)處理

1）離心。由于大豆廢液中含有比較明顯的固體雜質(zhì)，不利于抽濾的順利進行，所以首先在4 000 r/min的條件下對廢液進行離心處理，時間15 min。

2）抽濾。用循環(huán)水式多用真空泵對離心后得到的上清液進行抽濾，以除去大豆廢液中殘余的蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)，取其濾液。

3）CaCl2處理。根據(jù)前人多次對絮凝效果的實驗研究[10]，本課題選擇氯化鈣作為絮凝劑，預(yù)處理大豆廢液。實驗選取1 mol/L CaCl2對抽濾過的廢水進行處理，除去廢水中未完全沉降的大豆分離蛋白。首先對其加入量進行研究，選取 15、16、17、18、19 mL/L 5 個水平，將抽濾后的廢液分裝5瓶（每瓶各40 mL），在如下條件下進行處理：pH8、溫度50℃、緩慢攪拌時間15 min對大豆廢液進行預(yù)處理，選取最佳條件。

1.2.5 殼聚糖沉淀大豆乳清蛋白

本實驗以殼聚糖為絮凝劑將大豆乳清蛋白沉淀下來，將殼聚糖溶液以一定的用量加到經(jīng)氯化鈣預(yù)處理的大豆廢液中，在一定的溫度下絮凝一定時間。以得率為指標，考察處理溫度（15、20、25、30、35、40 ℃）、廢液 pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）、殼聚糖加入量（0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L） 和處理時間（20、25、30、35、40、45 min）這4個因素對葡萄糖異構(gòu)效果的影響。首先進行單因素實驗，在此基礎(chǔ)上，通過四因素三水平的正交實驗確定最佳工藝條件。實驗中每次廢液處理量為40 mL，每組實驗平行3次。

在本實驗中，殼聚糖使用前用3%醋酸進行溶解。然后絮凝預(yù)處理之后的大豆廢液，得到大豆乳清蛋白-殼聚糖復(fù)合物之后，烘干稱重。大豆乳清蛋白-殼聚糖復(fù)合物加蒸餾水攪拌，由于大豆乳清蛋白可溶于水，而殼聚糖不溶于水，沉淀下來，再經(jīng)過離心，實現(xiàn)絮凝劑的去除。

1.2.6 離心

用正交試驗得出的殼聚糖最佳沉淀效果對大豆廢液進行處理，在4 000 r/min條件下離心20 min，留沉淀棄上清。

1.2.7 除鹽

將離心得到的沉淀用水溶解（溶于水部分是可溶性乳清蛋白），4 000 r/min條件下離心20 min（除去不溶性的雜質(zhì)和殼聚糖），棄沉淀，上清液在4℃條件下透析24 h。

1.2.8 冷凍干燥

采用真空冷凍干燥法得到可溶性大豆乳清蛋白粉。

1.2.9 得率計算

大豆乳清蛋白得率/%=（大豆乳清蛋白-殼聚糖復(fù)合物質(zhì)量）/氯化鈣絮凝后廢水蛋白含量×殼聚糖絮凝所用廢液體積×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白質(zhì)標準曲線

采用考馬斯亮藍G-250法測廢水中蛋白質(zhì)含量，得到的蛋白質(zhì)標準曲線如圖1所示。

圖1 蛋白質(zhì)標準曲線Fig.1 The standard curve of protein

通過做標準曲線，得到直線方程y=0.641 4x-0.005 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6。根據(jù)此標準曲線測得大豆廢液中含蛋白質(zhì)1.62 mg/mL，用CaCl2預(yù)處理除去大豆分離蛋白及部分雜質(zhì)后上清液蛋白質(zhì)含量為1.49 mg/mL。

2.2 不同CaCl2用量對大豆分離蛋白除去效果

大豆廢水經(jīng)不同用量氯化鈣處理，除去大豆分離蛋白得到的結(jié)果如圖2所示。

圖2 氯化鈣用量對除大豆分離蛋白效果的影響Fig.2 The effect of calcium chloride content on the removal of soy protein isolated

圖2中橫坐標為每升大豆乳清廢水所需1 mol/L CaCl2的量，縱坐標為得到的大豆分離蛋白的質(zhì)量（大豆分離蛋白-CaCl2復(fù)合物干重減去加入氯化鈣質(zhì)量）。由圖2可知，CaCl2用量不同時，除去大豆分離蛋白的效果有顯著差異，且去除效果隨CaCl2用量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在1 mol/L CaCl2用量為18 mL/L時，除去大豆分離蛋白效果最好。另外由圖2可知，幾乎每個點的縱坐標值都超過了廢液中蛋白質(zhì)的含量，這是因為加入氯化鈣與溶液中的離子生成沉淀，與大豆分離蛋白同時沉淀下來，這同時減少了溶液中的雜質(zhì)離子含量。因此，在處理大豆乳清廢液時可以采用每升加入1 mol/L CaCl218 mL為最終用量，與吳海波等的研究結(jié)果一致[11]，即每升廢液中添加無水CaCl2（Mr=110.99 g/mol）的質(zhì)量約為 2 g。

2.3 不同的處理溫度對大豆乳清蛋白得率的影響

在pH6.5，殼聚糖用量為0.3 g/L，加熱時間35 min條件下，選取實驗溫度為 15、20、25、30、35、40 ℃處理廢液，離心得到沉淀，計算大豆乳清蛋白得率，結(jié)果如圖3所示。

圖3 處理溫度對大豆乳清蛋白沉淀效果的影響Fig.3 The effect of tempreture on the removal of soy whey protein

由圖3可知，隨著處理溫度的升高，40 mL經(jīng)氯化鈣預(yù)處理的乳清廢液中用殼聚糖沉淀出的大豆乳清蛋白的得率呈現(xiàn)降低趨勢[12]，溫度越低，越有利于大豆乳清蛋白的沉降，在處理溫度為15℃時，所沉淀出的大豆乳清蛋白的質(zhì)量最多，即得率最高。

2.4 不同pH對大豆乳清蛋白得率的影響

在溫度為30℃，殼聚糖用量為0.3 g/L，加熱時間35 min 條件下，選取 pH 為 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5 處理廢液，離心得到沉淀，計算大豆乳清蛋白得率，結(jié)果如圖4所示。

圖4 廢液pH對大豆乳清蛋白沉淀效果的影響Fig.4 The effect of wastewater pH on the removal of soy whey protein

由圖4可知，隨著廢液pH的升高，40 mL經(jīng)氯化鈣預(yù)處理的乳清廢液中用殼聚糖沉淀出的大豆乳清蛋白的得率呈現(xiàn)上升的趨勢，在pH為7時達到最大值，pH繼續(xù)增大時，大豆乳清蛋白的得率反而略有降低。比較各pH條件下所得到的大豆乳清蛋白的得率可知，pH為6.5～7.5之間時，廢液絮凝蛋白效果最好。

2.5 不同的殼聚糖用量對大豆乳清蛋白得率的影響

在溫度為30℃，pH6.5，加熱時間35 min條件下，選取殼聚糖用量為 0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L 處理廢液，離心得到沉淀，計算大豆乳清蛋白得率，結(jié)果如圖5所示。

圖5 殼聚糖用量對大豆乳清蛋白沉淀效果的影響Fig.5 The effect of the amount of chitosan on the removal of soy whey protein

由圖5可知，隨著殼聚糖用量的增多，40 mL經(jīng)氯化鈣預(yù)處理的乳清廢液中所沉淀出的大豆乳清蛋白的得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在殼聚糖用量為0.3 g/L時，所沉淀出的大豆乳清蛋白的得率最高。

2.6 不同的處理時間對大豆乳清蛋白得率的影響

在溫度為30℃，pH6.5，殼聚糖用量為0.3 g/L條件下，選取處理時間為 20、25、30、35、40、45 min 處理廢液，離心得到沉淀，計算大豆乳清蛋白得率，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，隨著絮凝時間的增加，40 mL經(jīng)氯化鈣預(yù)處理的乳清廢液中所沉淀得出大豆乳清蛋白的得率先升高后降低，在處理時間為40 min時得率達到最高。

圖6 處理時間對大豆乳清蛋白沉淀效果的影響Fig.6 The effect of the time on the removal of soy whey protein

2.7 正交試驗結(jié)果

根據(jù)上述四個單因素實驗結(jié)果，分析各個因素對沉淀效果的影響程度，確定正交實驗各個因素水平，設(shè)計正交實驗，以每瓶40 mL廢液進行實驗，各試驗均平行三組，根據(jù)正交實驗結(jié)果，對數(shù)據(jù)進行正交分析，確定各因素對沉淀效果的影響程度的大小，從而得到最佳沉淀條件。

表1 L9（34）正交試驗因素水平表Table 1L9（34）factors and levels of orthogonal test

根據(jù)表1進行四因素三水平正交試驗，結(jié)果如表2。

表2 四因素三水平正交試驗結(jié)果Table 2 The results of four factors three levels orthogonal

由表2可知，大豆乳清廢水中蛋白質(zhì)的最優(yōu)絮凝工藝條件為A1B3C3D3，即絮凝溫度為15℃，絮凝處理時間為45 min，廢液pH為7.5，絮凝劑殼聚糖用量為0.4 g/L。由極差分析可知，因素主次關(guān)系為A>C>D>B，即處理溫度為主要因素，其次為廢液的pH、絮凝劑殼聚糖用量和處理時間。在最佳工藝條件下，實驗室處理1 L廢水可得到大豆乳清蛋白-殼聚糖復(fù)合物干重1.018 g。將復(fù)合物用蒸餾水溶解，離心除去殼聚糖沉淀，測得上清液蛋白含量為0.618 mg/mL，計算得大豆乳清蛋白得率為41.48%。

3 結(jié)論

本研究采用二步絮凝法從大豆乳清廢水中提取可溶性大豆乳清蛋白，確定了最佳提取工藝條件。一步絮凝采用CaCl2作為預(yù)處理劑，在其用量為18 mL/L時，效果最好，可除去大部分大豆分離蛋白；二步絮凝采用殼聚糖作為絮凝劑，在處理溫度15℃，處理時間45 min，廢液pH7.5，殼聚糖用量為0.4 g/L時，大豆乳清蛋白-殼聚糖復(fù)合物最高得率可達68.3%，此復(fù)合物加入蒸餾水后，不溶性的殼聚糖可以采用離心方法去除，得到可溶性大豆乳清蛋白，然后對可溶性大豆乳清蛋白透析脫鹽真空冷凍干燥，最終蛋白得率為41.48%，即每升大豆乳清廢液可以得到0.618 g可溶性大豆乳清蛋白。此技術(shù)工藝簡單易行，條件溫和，可用于工業(yè)生產(chǎn)，但是對所得到的大豆乳清蛋白的功能性研究還要進一步探討，以期為大豆乳清蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)參考。

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