響應(yīng)面法優(yōu)化紫蘇多糖的水提工藝

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（1.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物黑龍江省高校重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150080；2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院食品科學(xué)與工程系，黑龍江哈爾濱 150500）

紫蘇，別名赤蘇、白蘇、香蘇等，學(xué)名Perilla frutescens，為唇形科一年生草本植物，具有特異的芳香，原產(chǎn)中國，我國華北、華中、華南、西南地區(qū)均有野生種和栽培種[1]。據(jù)醫(yī)學(xué)臨床研究，其莖、葉及種子可入藥；莖葉有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜[2]、解熱作用，可治療感冒、緩解魚蟹中毒等[3]：種子（果實）有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘及發(fā)散精神沉悶之效[4]。近些年來，紫蘇因其特有的活性物質(zhì)及營養(yǎng)成分，在抗凝血、抗血栓、調(diào)血脂、調(diào)節(jié)免疫功能、抗腫瘤、抗氧化等方面都具有顯著的藥理作用[5-7]，而且紫蘇油中還有大量的α-亞麻酸，成為一種備受世界關(guān)注的活性物質(zhì)[8]，經(jīng)濟價值十分顯著。俄羅斯、日本、韓國、美國、加拿大等國對紫蘇屬植物進行了大量的商業(yè)性栽種，開發(fā)出了食用油、藥品、淹漬品、化妝品等幾十種紫蘇產(chǎn)品[9]。迄今為止，國內(nèi)外對于紫蘇籽的利用多用于產(chǎn)品開發(fā)，而對活性物質(zhì)的提取研究卻鮮見報道。

本實驗利用微波提取速度快的特點，對微波法水提紫蘇籽中的多糖進行了研究，為紫蘇多糖的進一步研究奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫蘇籽：哈爾濱市同泰藥店。

甲醇、氯仿、無水乙醇、葡萄糖、苯酚、濃硫酸：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純；WG800微波爐：中國格蘭仕微波爐電器有限公司；UV 1810紫外分光光度計：中國普析通用儀器有限公司；H-1650臺式離心機：湖南湘儀離心機有限公司；WND-200中藥粉碎機：浙江偉能達有限公司。

1.2 方法

1.2.1 紫蘇籽的預(yù)處理

由于紫蘇籽中含有較多油脂，為了減小油脂對多糖提取率的影響，首先要進行預(yù)處理去除油脂。方法是將紫蘇籽稱重后粉碎，加入石油醚150 mL、水100 mL浸泡紫蘇粉末，靜置4 h后分層，上層為石油醚提取液，下層為含水的脫脂紫蘇。

1.2.2 多糖含量的測定

多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法[10]。得到線性回歸方程Y=0.015X-0.033，R=0.994，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.4 mg/mL。

1.2.3 紫蘇多糖提取率的單因素實驗

紫蘇多糖提取單因素試驗過程中，微波功率設(shè)5個水平分別為 800、640、480、320、160 W，微波提取時間設(shè) 5 個水平分別為 0.5、1.0、1.5、2、2.5 min，液料比設(shè) 5個水平分別為 10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1，分別進行單因素試驗測定紫蘇多糖提取率，每個試驗均設(shè)3個重復(fù)，取平均值。微波功率的設(shè)定參考牟番松等方法[11] 。

式中：A1為紫蘇籽鮮質(zhì)量；A2為紫蘇多糖干質(zhì)量。

1.2.4 響應(yīng)面法對微波提取條件的優(yōu)化

綜合單因素試驗結(jié)果，參照張大皓等[12]方法，通過Plackett-Burman試驗統(tǒng)計分析，確定試驗的主因素和后續(xù)實驗的中心點條件，然后在最陡爬坡實驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計實驗因素及水平，應(yīng)用Box-Behnken中心組合進行三因素三水平的試驗設(shè)計（取a=2），通過響應(yīng)面法對紫蘇籽中多糖的微波提取條件進行優(yōu)化。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用Design Expert7.0軟件中的多元線性回歸分析程序，擬合二階多項式方程。并對回歸方程的系數(shù)進行顯著性比較（F檢驗），研究微波功率及提取時間，液料比對紫蘇多糖提取率的影響，再根據(jù)響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析優(yōu)化提取率。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫蘇多糖提取率的單因素實驗

2.1.1 液料比對紫蘇多糖提取率的影響

選取微波功率為640 W，提取時間為2 min，選擇5種不同的液料比，結(jié)果（如圖1）所示，隨著液料比的增大，提取率會明顯的提高，但當(dāng)液料比大于25∶1時，紫蘇多糖提取率增加的幅度不大，而且由于液料比過大會造成溶劑用量顯著增加，因此，本試驗選擇液料比為25∶1。

圖1 不同液料比對提取率的影響Fig.1 Effect of liquid/material ratio on the extraction ability

2.1.2 微波功率對紫蘇多糖提取率的影響

選取液料比為25∶1（mL/g），微波提取時間2 min，考察5種不同微波功率的影響，結(jié)果（如圖2）所示，改變微波功率對紫蘇多糖提取率影響較大。紫蘇多糖隨著微波功率的增加呈現(xiàn)一個先上升后下降的趨勢。根據(jù)姚菁華等[13]的分析，微波加熱使細胞內(nèi)液態(tài)水氣化產(chǎn)生壓力，沖破細胞膜和細胞壁形成微小孔洞，有利于細胞內(nèi)紫蘇多糖的溶出；微波功率過大，細胞受熱加劇，部分紫蘇多糖的結(jié)構(gòu)會破壞。故本試驗選擇提取微波功率為480 W左右。

圖2 不同微波功率對提取率的影響Fig.2 Effect of mircowave power on the extraction ablity

2.1.3 微波提取時間對紫蘇多糖提取率的影響

選定液料比為25∶1（mL/g），微波功率為480 W，考察5種不同微波提取時間的影響。結(jié)果（如圖3）所示，在1.5 min內(nèi)隨著提取時間的延長，提取率隨之增加。1.5 min后紫蘇多糖得率出現(xiàn)緩慢下降，這主要是由于微波在1.5 min內(nèi)對細胞膜的破壞作用較大，溶出物多，提取率也高。超過1.5 min后，紫蘇多糖提取率呈下降趨勢，因此選擇微波提取時間為1.5 min左右。

圖3 不同提取時間對提取率的影響Fig.3 Effect of extracting time on the extraction ability

2.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案

首先，在單因素試驗基礎(chǔ)上，以紫蘇多糖提取率（Y）為響應(yīng)值，進行分式析因設(shè)計，確定了提取率的主要影響因子為液料比，達到了極顯著的水平，用最陡爬坡路徑逼近最大響應(yīng)區(qū)域?qū)嶒?，采用Design expert程序中心組合試驗分析法（Box-Behnken）設(shè)計試驗，以 X1=（Z1-480）/160，X2=（Z2-1.5）/0.5，以 X3=（Z3-25）/5為自變量，實驗因素水平見表1。響應(yīng)面分析實驗中17個試驗點分為兩類：其一是析因點，自變量取值在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維頂點，共有12個析因點；其二是零點，為區(qū)域中心點，零點試驗重復(fù)5次，用來估計試驗誤差，響應(yīng)面分析方案及實驗結(jié)果見表2。

表1 分析因子及水平表Table 1 Levels and factors of analysis

表2 響應(yīng)面分析方案與試驗結(jié)果Table 2 The experiment design and results of RSM

2.3 響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)處理分析

利用Design expert軟件對表2數(shù)據(jù)進行回歸擬合分析，分析結(jié)果如表3。經(jīng)回歸擬合后，確立如下回歸方程預(yù)測模型：

Y（%）=-10.9+0.018 7 X1+4.72X2+0.402 X3-0.001 59X1X2+0.000 046 9X1X3-0.014X2X3-0.000 020 6X12-1.14X22-0.007 58X32

表3 回歸分析結(jié)果Table 3 Results of regression analysis

從表3中可以看出，此模型P＜0.05，響應(yīng)面回歸模型達到顯著水平。影響紫蘇多糖提取率的因素主次因素為 X3＞X1＞X2，模型中 X1X2、X12、X22和 X32對提取率的影響極顯著（P＜0.05）。從該模型的R2=0.969來看，此模型與實際試驗擬合較好，可用該回歸方程代替試驗真實點對實驗結(jié)果進行分析，但是試驗失擬性小于0.1，說明實驗數(shù)據(jù)與模型存在不相符的區(qū)域，會造成模型部分區(qū)域擬合失真。

2.4 交互作用分析

為進一步考察3個因素兩兩之間交互作用對紫蘇多糖提取率的影響，對其響應(yīng)面曲線進行分析。圖4（A）、（B）、（C）直觀的給出了兩兩因素交互作用對提取率影響的響應(yīng)面圖?？梢钥闯?，X1（微波功率）對響應(yīng)值的影響較大，表現(xiàn)為曲線比較陡，這與回歸分析的結(jié)果吻合。

2.4.1 微波功率和提取時間的交互作用

由圖4可知，響應(yīng)曲面的坡度相對平緩，表明響應(yīng)值（提取率）對微波功率和提取時間的改變并不那么敏感，但是可以看出在響應(yīng)面有兩個角坡度較陡，說明微波功率和提取時間的適宜范圍較窄，大致可以看出，當(dāng)微波功率在360 W～580 W，提取時間在1.12 min～1.81 min之間時對提高提取率最有利，其預(yù)測提取率為1.97%。

圖4 紫蘇多糖提取率與微波功率和提取時間之間的響應(yīng)面圖Fig.4 The peak response area of the interactive effects of microwave power and duration time on the extraction ability of polysaccharide

2.4.2 微波功率和液料比的交互作用

由圖5可知，響應(yīng)曲面的坡度相對較陡，表明響應(yīng)值（提取率）對微波功率與液料比的變化較敏感。從響應(yīng)曲面可以看出，液料比變化對紫蘇多糖提取率的影響更大，當(dāng)微波功率在360 W～580 W、液料比在23.7～30之間對提高提取率最有利，提取率預(yù)測值為2.0%。

圖5 紫蘇多糖提取率與微波功率和液料比之間的響應(yīng)面圖Fig.5 The peak response area of the interactive effects of microwave power and liquid/material ratio on the extraction ability of polysaccharide

2.4.3 提取時間和液料比的交互作用

圖6 紫蘇多糖提取率與提取時間和液料比之間的響應(yīng)面圖Fig.6 The peak response area of the interactive effects of duration time and liquid/material ratio on the extraction ability of polysaccharide

由圖6可知，響應(yīng)曲面坡度相對較陡，表明響應(yīng)值（提取率）對提取時間和液料比的交互作用較敏感。從等高線看，液料比的變化對響應(yīng)值的影響較大。當(dāng)提取時間在1.12 min～1.81 min、液料比在23.7～30之間時對提高提取率最有利，提取率預(yù)測值為2.01%。

2.5 最優(yōu)工藝參數(shù)的驗證

由Design expert分析，最大響應(yīng)值（Y）=1.99時，X1，X2，X3對應(yīng)的編碼值分別為 X1=610，X2=1.31，X3=28.5，說明紫蘇多糖的最佳提取條件為：微波功率610 W，微波提取時間 1.31 min、液料比 28.5∶1，紫蘇多糖的提取率為1.99%。在最佳提取工藝條件下進行提取驗證試驗，重復(fù)3次，取平均值，紫蘇多糖的提取率為2.02%，與優(yōu)化目標(biāo)值非常接近。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面分析法對紫蘇籽中多糖的水提工藝進行了優(yōu)化，首先運用Placket-t Burman法確定出液料比為最重要的影響因素；然后通過最陡爬坡實驗確定了因素水平，最后采用Box-Behnken設(shè)計和SAS軟件分析確定了最優(yōu)的提取工藝為：微波功率610 W，微波提取時間1.31 min，液料比28.5∶1，紫蘇多糖的提取率為1.99%。而朱建飛等[14]利用傳統(tǒng)正交試驗方法得到的紫蘇多糖提取率最大為8.6%，提取時間為4 h，這比本實驗的提取率時間長，改用微波提取方法后，提取時間大大縮短，但提取率降到1.99%，降低了不少。曾哲靈等[15]通過響應(yīng)面法優(yōu)化了玫瑰茄紅色素的提取工藝，張君萍等[16]利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化沙蔥籽多糖提取工藝，都取得了不錯的試驗效果。本試驗通過響應(yīng)面法優(yōu)化紫蘇多糖的提取率，同樣取得了優(yōu)化的紫蘇多糖的水提工藝。

[1] 韓麗,李福臣,劉洪富,等.紫蘇的綜合開發(fā)利用[J] .食品研究與開發(fā),2004,25(3):24-26

[2] M Aritomi,T Kumori,T Kawasaki,et al.Cyanogenic glycosides in leaves Perilla frutescens var.acuta[J] .Phytochemistry,1985,24(10):2438-2439

[3] 顧文娟,朱陳玨.紫蘇藥理作用研究進展[J] .黑龍江畜牧獸醫(yī),2006(8):26-28

[4] 張衛(wèi)明,石雪萍.紫蘇全草營養(yǎng)成分測定[J] .食品研究與開發(fā),2009,30(2):132-135

[5] 余大書,劉志剛,韓杰才.紫蘇油抗氧化性研究[J] .哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報,2001,33(5):658-660

[6] 蒲海燕,李影球,李梅.紫蘇的功能性成分及其產(chǎn)品開發(fā)[J] .中國食品添加劑,2009(2):133-137

[7] 陶國琴,李晨.α-亞麻酸的保健功效及應(yīng)用[J] .食品科學(xué),2000,21(12):141-143

[8] Y Koezuka,G Honda,M Tabata.Genetic control of the chemical composition of volatile oils in Perilla frutescens[J] .Original Research Article,1986,25(4):859-863

[9] M Aritomi,T Kumori,T Kawasaki,et al.Genetic control of phenylpropanoids in Perilla frutescents[J] .Phytochemistry,1986,25(9):2085-2087

[10] 林海祿,彭雪嬌,羅明標(biāo),等.微波輔助提取八角茴香中莽草酸的工藝研究[J] .食品工業(yè)科技,2007,28(3):137-139

[11] 牟番松,羅猛,付玉杰,等.正交實驗優(yōu)化長春堿微波輔助提取工藝[J] .化學(xué)工程,2008,36(7):62-65

[12] 賀寅,王強,鐘葵.響應(yīng)面優(yōu)化酶法提取龍眼多糖工藝[J] .食品科學(xué),2011,32(2):79-83

[13] 姚菁華,肖雷,李慧蓉,等.響應(yīng)面法優(yōu)化莽草酸微波輔助提取工藝[J] .北京化工大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2009,36(增刊):14-17

[14] 朱建飛,白紹文,陳楠,等.紫蘇餅粕多糖水提工藝研究[J] .安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(1):266-267

[15] 曾哲靈,郝純青,呂偉,等.響應(yīng)面法優(yōu)化玫瑰茄紅色素提取工藝[J] .食品科學(xué),2010,31(26):47-51

[16] 張君萍,侯喜林,董海艷,等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化超聲波提取沙蔥籽多糖工藝[J] .食品科學(xué),2011,32(2):98-102