液體磁流芯片檢測牛白血病方法的建立

趙衛(wèi)東，劉偉，王玉玲，劉國紅，鄭文杰

（天津出入境檢驗檢疫局動植物和食品檢測中心，天津300461）

牛白血?。‥BL）最初于1878年在德國被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已呈全球性分布，且發(fā)病范圍不斷擴大，在某些牛群中血清陽性率高達60%[1]，中國的安徽、重慶、新疆、江西等地都有發(fā)病的報道，且感染率較高（10%～50%）。該病病程長，一般在癥狀出現(xiàn)數(shù)周或數(shù)月后死亡。在歐洲有該病流行的牛群，每年由于本病所導(dǎo)致的死亡率約為2%，也有的高達5%。該病被認(rèn)為有明顯的家系傾向和免疫抑制性，現(xiàn)已經(jīng)成為影響?zhàn)B牛業(yè)的重要傳染病之一[2-4]。帶有傳染病的奶牛不但會引起家畜傳染病的爆發(fā)，還會影響牛奶和奶制品的品質(zhì)。該病是人畜共患病，可經(jīng)牛奶途徑傳染給人類，引起消費者尤其是免疫力低下的弱勢人群發(fā)病。

目前國外對牛白血病的檢測主要是采用ELISA方法，已成功研制出基于gp51、p24抗體的檢測試劑盒[5-6]。國內(nèi)對牛白血病病毒檢測方法較少，有過應(yīng)用PCR和PCR-ELISA方法進行檢測的報道[7-8]，但由于技術(shù)原因，未有成熟的診斷產(chǎn)品出現(xiàn)，主要使用國外進口的ELISA試劑盒對EBL實施檢疫和市場普查。而對國外檢測試劑盒的過分依賴，使我國進口牛檢疫和普查工作處于成本高且容易受制的被動狀態(tài)。一旦病毒傳入，不僅將直接損害奶牛養(yǎng)殖戶的切身利益，妨礙我國“三農(nóng)”工作的順利進行，而且還將威脅我國人民的健康和生命安全。

本研究自主研發(fā)了液體磁流芯片方法，可取代國外試劑盒檢測方法，用于對我國進口牛和養(yǎng)殖牛EBL的檢疫和普查。

1 材料與方法

1.1 試劑材料與儀器

gp51肽偶聯(lián)免疫磁珠：由天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心實驗室制備并保存于4℃冰箱內(nèi)備用；5%豬血清：豬血清用PBST稀釋到需要濃度；5%羊血清：羊血清用PBST稀釋到需要濃度；5%脫脂乳：準(zhǔn)確稱量5g脫脂乳，溶于90mLPBST溶液中，加熱煮沸，定容至100mL；PBST洗滌液：1000mL10mmol/L pH 7.4的PBS中加入0.5 mL Tween-20；HRP標(biāo)記的兔抗牛IgG結(jié)合物：購于北京博鰲森生物技術(shù)有限公司。

底物溶液：

A 液：TMB（3、3’、5、5’—四甲基聯(lián)苯胺）200 mg，無水乙醇100 mL，加雙蒸水，至1 000 mL。

B液：（100 mmol/L檸檬酸-200 mmol/L Na2HPO4緩沖液，pH5.0～5.4）：檸檬酸 9.33 g，Na2HPO414.6 g，加三蒸水至1 000 mL，調(diào)pH至5.0～5.4。

臨用前分別取A液、B液各5mL，混勻，加入50μL的30%H2O2。

終止液（2 mol/L H2PO4）：分別取蒸餾水600 mL和濃硫酸100 mL，混勻，定容至900 mL。

移液槍；酶標(biāo)儀：SynergyTM4，美國伯騰儀器有限公司；磁力分離板：天津倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心。

1.2 方法

1.2.1 封閉液及待檢血清最佳稀釋度的確定

吸取100 μL gp51肽偶聯(lián)免疫磁珠于酶標(biāo)板中，放在磁力分離板上，吸棄上層清液。加入不同種類封閉液：5%豬血清、5%脫脂乳，5%羊血清 100 μL/孔，37℃孵育30 min后，放在磁力分離板上，吸棄上層清液，PBST 洗滌磁珠，1 min/次×2；分別加入已做 1 ∶50、1 ∶100、1 ∶200倍稀釋的待檢血清，100 μL/孔，37 ℃孵育30 min，放在磁力分離板上，吸棄上層清液，PBST洗滌磁珠，1 min/次×3。HRP兔抗牛IgG做1∶10 000倍稀釋，37℃孵育 30 min，PBST 洗滌磁珠，1 min/次×3次；加入底物，37℃反應(yīng)10 min后，在酶標(biāo)儀上讀出OD450 值，選擇當(dāng)陽性血清＞0.750，陰性＜0.250 時，P/N最大的封閉液和血清稀釋度為工作濃度。

1.2.2 HRP兔抗牛IgG最佳工作濃度的確定

吸取100 μL gp51肽偶聯(lián)免疫磁珠于酶標(biāo)板中，放在磁力分離板上，吸棄上層清液，加入最佳封閉液，封閉結(jié)束后，放在磁力分離板上，吸棄上層清液，加入最適稀釋度的血清，37℃孵育30 min，放在磁力分離板上，吸棄上層清液，PBST洗滌磁珠后，分別加入按1∶5 000、1∶10 000、1∶15 000倍比稀釋的 HRP 兔抗牛IgG，37℃孵育 30 min，PBST 洗滌磁珠，1 min/次×3次；加入底物A、B液，37℃反應(yīng)10 min后，在酶標(biāo)儀上讀出OD450值。選擇當(dāng)陽性血清＞0.750，陰性血清＜0.200時，P/N最大的抗體稀釋度為工作濃度。

1.2.3 與相關(guān)檢測方法的對比分析

Svanova公司BLV gp51-Ab試劑盒法，實驗步驟見試劑盒說明書。

本實驗方法：吸取100 μL gp51肽偶聯(lián)免疫磁珠于酶標(biāo)板中，放在磁力分離板上，吸棄上層清液。加入5%豬血清封閉液100 μL/孔，37℃孵育30 min后，放在磁力分離板上，吸棄上層清液，PBST洗滌磁珠，1 min/次×2；分別加入已做1∶50倍稀釋的待檢血清，100 μL/孔，37 ℃孵育 30 min，放在磁力分離板上，吸棄上層清液，PBST 洗滌磁珠，1 min/次×3；HRP 兔抗牛IgG做1∶10 000倍稀釋，37℃孵育30 min，PBST洗滌磁珠，1 min/次×3次；分別加入底物 A、B 液，37℃反應(yīng)10 min后，在酶標(biāo)儀上讀出OD450值。

2 結(jié)果分析

2.1 不同血清稀釋度及封閉液ELISA結(jié)果

選取三種封閉液：5%豬血清、5%羊血清、5%脫脂乳，待檢牛血清按 1 ∶50、1∶100、1∶200 倍比稀釋，與封閉液組成方陣，按照以上步驟進行ELISA，結(jié)果見表1。

表1 不同血清稀釋度及封閉液ELISA結(jié)果Table 1 Results of different serum samples and blocking solutions

從表1中可看出，用5%豬血清或5%的脫脂乳做封閉液，隨血清稀釋度的增加陽性血清及陰性血清OD450值顯著下降，同一血清稀釋度下，用5%豬血清或5%的脫脂乳封閉，陽性血清OD450大致相同，陰性血清OD450：5%豬血清＜5%的脫脂乳。5%脫脂乳封閉時，陽性血清OD450值明顯低于5%豬血清或5%的脫脂乳封閉，陰性血清OD450值大致相同。故羊血清的封閉效果不如豬血清或脫脂乳，而豬血清對陰性血清的封閉作用優(yōu)于脫脂乳。不同封閉條件下的P/N：5%豬血清＞5%脫脂乳＞5%羊血清。因此，得到符合條件的組合為：5%豬血清封閉，血清1∶50倍稀釋。

2.2 不同兔抗牛IgG稀釋度ELISA結(jié)果

采用5%豬血清封閉，待檢血清做1∶50倍比稀釋，把HRP兔抗牛IgG分別做1∶5 000、1∶10 000、1∶15 000倍稀釋，按照以上步驟進行ELISA，結(jié)果見表2。

表2 不同兔抗牛IgG稀釋度ELISA結(jié)果Table 2 Results of different HRP-labeled rabbit anti-cow IgG

本實驗的判定方法為：當(dāng)血清的OD值＞0.750時判斷為陽性，血清OD值＜0.250時判斷為陰性，若有疑似血清，判斷P/N值，當(dāng)P/N值≥3時判斷為陽性，P/N值＜3時判斷為陰性。

2.3 Svanova公司BLV gp51-Ab試劑盒與本實驗方法檢測牛血清結(jié)果

選取41份牛血清，分別采用國外Svanova試劑盒和本實驗方法進行檢測，比較檢測結(jié)果，見表3和表4。

表3 BLV gp51-Ab試劑盒檢測血清結(jié)果Table 3 Results of BLV gp51-Ab kit to serum

根據(jù)試劑盒說明，當(dāng)PP≥15時，判斷為陽性，當(dāng)PP＜15時，判斷為陰性。由表3中我們可以看出陽性血清為 6 份，血清編號分別為 0091，0247，0026，0113，0141，0138。陰性血清為35份。

表4 液體磁流芯片法檢測血清結(jié)果Table 4 Results of magnetic fluid chip method to serum

根據(jù)本實驗方法，當(dāng)OD值＞0.750時判斷為陽性，當(dāng)OD值＜0.250時，判斷為陰性。由表4可知，檢出陽性血清 6 份，分別為 0091，0247，0026，0113，0141，0138。其中，疑似血清為3972，3278，0171，進一步采用P/N值法判定，血清3278和3972的P/N值＜3，判斷為陰性；血清0171的P/N值＞3，判斷為陽性。Svanova公司BLV試劑盒檢測出的陽性血清本實驗方法均檢測出來。BLV試劑盒檢測血清0171為陰性，而本實驗方法檢測為陽性。兩種方法檢測到的陽性血清符合率100%，陰性血清符合率為97.5%。我們可以判定此方法可用于牛白血病病毒的檢測。

表5 與Svanova試劑盒檢測結(jié)果的比較Table 5 The result comparation of magnetic fluid chip method and BLV gp51-Ab kit

3 結(jié)論與討論

牛白血病病毒是引起EBL的一種外源性逆轉(zhuǎn)錄病毒。該病毒感染牛后，牛體內(nèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白抗囊膜糖蛋白抗原gp51可對其產(chǎn)生強烈的免疫應(yīng)答，本實驗室根據(jù)對gp51蛋白表位的分析預(yù)測和磁珠偶聯(lián)技術(shù)，制備了gp51肽偶聯(lián)免疫磁珠，通過對封閉液、血清稀釋濃度和HRP兔抗牛IgG工作濃度的篩選和優(yōu)化，建立了針對牛白血病的液體磁流芯片檢測方法。本方法可同時對40個樣品進行測定，檢測時間為2 h～3 h，通過與Svanova公司gp51-Ab試劑盒進行測定比較，表明2種方法檢測到的陽性血清符合率為100%，陰性血清符合率為97.1%。因此，本方法可完全替代國外試劑盒檢測方法，降低檢測費用，擺脫了長期對國外試劑盒的依賴。

在研究過程中，主要采用移液槍、磁力架等簡單設(shè)備及手工操作，因操作人員及手法熟練程度的差異，初期常出現(xiàn)洗滌過程中偶聯(lián)磁珠部分流失的問題，出現(xiàn)部分孔結(jié)果重復(fù)性不好的問題，需要對操作人員進行短期的技術(shù)及操作要領(lǐng)培訓(xùn)。如果采用自動化的磁流洗滌設(shè)備，可明顯減少誤差，進一步提高檢測準(zhǔn)確率和重復(fù)性。

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