蘆薈銀杏制劑對乙醇氧化小鼠的抗氧化研究

白銀花，李曉，劉婧，張立實(shí)

（四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院，四川成都610041）

蘆薈銀杏復(fù)合制劑為蘆薈凝膠凍干粉與銀杏葉提取物復(fù)合制劑。蘆薈（Aloe）是百合科多年生常綠肉質(zhì)草本植物，富含多糖、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸以及多種礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)和多酚類還原性物質(zhì)，被譽(yù)為“21世紀(jì)最佳保健食品”和純天然抗氧化劑，在食品、化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛[1]。銀杏Ginkgo biloba L.又稱白果樹、公孫樹，屬銀杏科銀杏屬裸子植物，主產(chǎn)中國[2]。其葉、果和外種皮等皆具有藥用價(jià)值，被稱為“全身都是寶的活化石”[3]。國內(nèi)外的一些研究表明，銀杏葉所含的黃酮化合物具有明顯抗氧化活性和抗自由基活性[4-6]?，F(xiàn)擬用大劑量乙醇造小鼠氧化損傷模型，研究蘆薈銀杏復(fù)合制劑的抗氧化作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆薈銀杏復(fù)合制劑：XX生物科技有限公司；清潔級雄性昆明種小鼠（50只，體質(zhì)量25 g～30 g，8周齡）：成都達(dá)碩生物科技有限公司，動物合格證號SCXK（川）2008-24。

50%乙醇（分析純）：寶信生物科技有限公司；GSH試劑盒、T-SOD試劑盒、GSH-Px試劑盒、MDA試劑盒、蛋白質(zhì)羰基含量試劑盒：南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2800型紫外-可見分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；BIO-RAD680酶標(biāo)儀：上海普林斯頓生物科技發(fā)展有限公司；AU400生化分析儀：奧林巴斯中國有限公司；DY89-IDI電動玻璃勻漿器：寧波新芝科技有限公司；Thermo ST16低溫高速離心機(jī)Thermo Scientific；Xiang Yi-L530高速臺式離心機(jī)：長沙湘儀離心機(jī)儀器公司；HHSYZL-Ni電熱恒溫水浴箱北京長風(fēng)儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組

實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)溫度為18℃～22℃，濕度為55%～75%，自然光照，自由采食和飲水。實(shí)驗(yàn)前將50只小鼠在實(shí)驗(yàn)環(huán)境下給予基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，按體質(zhì)量隨機(jī)分成5組，分別為正常對照組、模型對照組、蘆薈銀杏復(fù)合制劑配方二低、中、高劑量組。

1.3.2 造模及給藥方法

低、中、高 3個(gè)劑量組分別按 500、1 000、2 000 mg/（kg·bw·d）的劑量灌胃給予不同濃度受試樣品，溶劑對照組和模型對照組給予同體積雙蒸水，連續(xù)灌胃30d，末次灌胃后，模型對照組和3個(gè)劑量組禁食16 h（過夜），然后1次性灌胃給予50%乙醇12mL/（kg·bw），正常對照組不作處理。

1.3.3 測試樣品的制備和檢測

模型對照組和實(shí)驗(yàn)劑量組灌胃乙醇6 h后，股動脈取血致死，1.5mLEP管收集血液，3000r/min離心10min，取上清液備用。解剖小鼠，取肝臟，稱取0.4 g～0.5 g和0.1 g～0.2 g肝臟組織，分別加入9倍體積的生理鹽水（用于測肝臟GSH、T-SOD、GSH-Px和MDA含量）和蛋白質(zhì)羰基含量測試盒試劑一（用于測肝臟蛋白質(zhì)羰基含量），于勻漿器中制成10%的組織勻漿液，2 500 r/min離心10 min，取上清液備用。

采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒檢測血清和肝組織抗氧化物質(zhì)GSH含量、抗氧化酶TSOD和GSH-Px活力、脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA含量以及蛋白質(zhì)羰基含量；采用全自動生化分析儀測定肝組織蛋白含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆薈銀杏復(fù)合制劑對小鼠一般情況的影響

蘆薈銀杏復(fù)合制劑對小鼠一般情況的影響見表1。

表1 蘆薈銀杏復(fù)合制劑對小鼠體重的影響（±s）Table 1 Aloe gingko compound preparation effect on body weight in mice（±s）

表1 蘆薈銀杏復(fù)合制劑對小鼠體重的影響（±s）Table 1 Aloe gingko compound preparation effect on body weight in mice（±s）

組別 劑量/（g/kg·bw）動物數(shù)/只 0 d體重/g 15 d體重/g 30 d體重/g正常對照 0.00 10 27.70±1.42 39.00±3.16 45.50±2.55模型對照 0.00 10 28.30±1.83 42.30±3.30 46.10±2.96低劑量 0.19 10 28.60±1.37 42.00±2.63 47.00±2.54中劑量 0.38 10 28.70±2.54 39.50±2.91 46.90±1.73高劑量 0.76 10 28.70±1.61 40.60±3.31 47.00±1.83

表1表明，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，模型對照組和各受試配方組與正常對照組比較體重均略有增加但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組動物在實(shí)驗(yàn)過程中活動正常，無異常表現(xiàn)，表明各配方對小鼠生長發(fā)育和一般健康情況無不良影響。

2.2 蘆薈銀杏復(fù)合制劑對小鼠血清抗氧化能力的影響

蘆薈銀杏復(fù)合制劑對小鼠血清抗氧化能力的影響，見表2。

表2 蘆薈銀杏復(fù)合制劑對小鼠血清GSH、SOD、GSH-Px和MDA的影響（±S，N=10）Table 2 Aloe gingko compound preparation in mice serum GSH ，SOD，GSH-Px and MDA（±S，N=10）

表2 蘆薈銀杏復(fù)合制劑對小鼠血清GSH、SOD、GSH-Px和MDA的影響（±S，N=10）Table 2 Aloe gingko compound preparation in mice serum GSH ，SOD，GSH-Px and MDA（±S，N=10）

△：*表示與正常對照組比較P＜0.05；**表示與正常對照組比較P＜0.01；○表示與模型對照組比較P＜0.05；○○表示與模型對照組比較P＜0.01。

組別GSH/（mg/L）SOD/（U/mL）GSH-Px/（U/mL）MDA/（nmol/mL）正常對照 12.781±2.385 167.855±25.678 951.429±174.876 11.000±6.416模型對照 6.829±1.490** 95.056±25.277** 782.143±153.031* 39.500±10.659**低劑量 10.839±2.211○○ 143.836±43.387○○ 746.786±178.003 20.000±7.071○○中劑量 14.034±4.393○○ 150.791±35.146○○ 768.214±169.261 17.500±10.607○○高劑量 19.485±3.076○○ 154.501±27.365○○ 981.429±131.533○○ 8.500±4.116○○

表2表明，給予大劑量乙醇造模，模型對照組與溶劑對照組比較，小鼠血清GSH、SOD水平下降（P＜0.01），GSH-Px水平降低（P＜0.05），MDA 水平升高（P＜0.01）。說明乙醇氧化損傷模型造模成功。

給予不同劑量的蘆薈銀杏復(fù)合制劑30天后，經(jīng)大劑量乙醇造模，各實(shí)驗(yàn)組與模型對照組比較，小鼠血清GSH、SOD水平隨蘆薈銀杏復(fù)合制劑濃度增加升高（P＜0.01）；高劑量組 GSH-Px水平升高（P＜0.05）；MDA水平隨蘆薈銀杏復(fù)合制劑濃度增加降低（P＜0.01）。說明蘆薈銀杏復(fù)合制劑能夠使乙醇氧化損傷模型小鼠血清抗氧化物質(zhì)GSH含量增加，抗氧化酶SOD和GSH-Px活力升高，脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA含量降低。

2.3 蘆薈銀杏復(fù)合制劑對小鼠肝組織抗氧化能力的影響

蘆薈銀杏復(fù)合制劑對小鼠肝組織抗氧化能力的影響，見表3。

表3 蘆薈銀杏復(fù)合制劑對小鼠肝組織GSH、SOD、GSH-Px、MDA和蛋白質(zhì)羰基的影響（±S，N=10）Table 3 Aloe gingko compound preparation in mice liver tissue GSH，SOD，GSH-Px，MDA and the effects of protein carbonyl（±S，N=10）

表3 蘆薈銀杏復(fù)合制劑對小鼠肝組織GSH、SOD、GSH-Px、MDA和蛋白質(zhì)羰基的影響（±S，N=10）Table 3 Aloe gingko compound preparation in mice liver tissue GSH，SOD，GSH-Px，MDA and the effects of protein carbonyl（±S，N=10）

△：*表示與正常對照組比較P＜0.05；**表示與正常對照組比較P＜0.01；○表示與模型對照組比較P＜0.05；○○表示與模型對照組比較P＜0.01。

組別GSH/（mg/gprot）SOD/（U/mgprot）GSH-Px/（U/mgprot）溶劑對照 6.808±1.467 195.843±21.325 365.721±65.858模型對照 5.497±0.809* 166.743±9.030** 311.444±47.389*低劑量 10.275±1.260○○ 180.218±13.822 353.854±38.931中劑量 15.274±1.752○○ 228.315±20.561○○ 541.652±72.063○○高劑量 19.378±1.733○○ 218.276±14.876○○ 471.245±49.828○○MDA/（nmol/mgprot）0.950±0.325 2.462±0.278**0.751±0.348○○0.738±0.114○○0.543±0.263○○蛋白質(zhì)羰基/（nmol/mgpro）3.554±0.965 6.352±1.031**4.550±0.913○○2.552±0.918○○2.220±0.607○○

表3表明，給予大劑量乙醇造模，模型對照組與溶劑對照組比較，小鼠肝組織GSH和GSH-Px水平下降（P＜0.05），SOD 水平下降（P＜0.01），MDA 和蛋白質(zhì)羰基水平升高（P＜0.01）。說明乙醇氧化損傷模型造模成功。

給予不同劑量的蘆薈銀杏復(fù)合制劑30天后，經(jīng)大劑量乙醇造模，各實(shí)驗(yàn)組與模型對照組比較，小鼠肝組織GSH水平隨蘆薈銀杏復(fù)合制劑濃度增加升高（P＜0.01）；蘆薈銀杏復(fù)合制劑中、高劑量組SOD和GSH-Px水平升高（P＜0.01）；MDA和蛋白質(zhì)羰基水平隨蘆薈銀杏復(fù)合制劑濃度增加降低（P＜0.01）。說明隨蘆薈銀杏復(fù)合制劑能夠使乙醇氧化損傷模型小鼠肝組織抗氧化物質(zhì)GSH含量增加，抗氧化酶SOD和GSH-Px活力升高，脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA含量降低，蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物蛋白質(zhì)羰基含量降低。

3 結(jié)論

乙醇大量攝入，可激活氧分子產(chǎn)生自由基，導(dǎo)致組織細(xì)胞過氧化效應(yīng)及體內(nèi)還原性谷胱甘肽的耗竭[7]。灌胃大劑量乙醇是目前最新的衰老造模法。灌胃大劑量乙醇后，SOD活性下降，MDA含量升高[8-9]。本實(shí)驗(yàn)中，給予50%乙醇12 mL/（kg·bw）造模，模型對照組與溶劑對照組比較，小鼠血清和肝組織GSH、SOD、GSHPx水平均降低，MDA和蛋白質(zhì)羰基水平均升高。說明乙醇氧化損傷模型造模成功。

機(jī)體防御體系的抗氧化能力的強(qiáng)弱與健康程度存在著密切聯(lián)系[10-11]。GSH的主要生理作用是清除體內(nèi)的自由基，做為體內(nèi)一種重要的抗氧化劑，保護(hù)蛋白質(zhì)和酶等分子中的巰基。GSH-Px和SOD是機(jī)體內(nèi)兩種重要的抗氧化酶。GSH-Px能催化過氧化氫的分解，SOD能夠清除超氧陰離子自由基，這兩種酶活力的變化能反映機(jī)體氧化損傷的程度；MDA和蛋白質(zhì)羰基分別是脂質(zhì)和蛋白質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，它們的變化可以反映細(xì)胞損傷的程度[12-13]。大量研究表明，當(dāng)機(jī)體遭受自由基攻擊而被氧化時(shí)，抗氧化劑的注入和使用，使抗氧化物質(zhì)GSH含量增加，血清和肝組織中抗氧化酶類SOD和GSH-Px活性等酶活性提高，MDA和蛋白質(zhì)羰基含量下降，從而使機(jī)體的抗氧化能力增強(qiáng)[14-15]。

本實(shí)驗(yàn)中，給予不同劑量的蘆薈銀杏復(fù)合制劑30天后，經(jīng)大劑量乙醇造模，實(shí)驗(yàn)劑量組與模型對照組比較，小鼠血清和肝組織GSH、SOD、GSH-Px水平升高，MDA和蛋白質(zhì)羰基水平降低。說明蘆薈銀杏復(fù)合制劑能夠使乙醇氧化損傷模型小鼠血清和肝組織抗氧化物質(zhì)GSH含量增加，抗氧化酶SOD和GSH-Px活力升高，脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA含量降低，蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物蛋白質(zhì)羰基含量降低。

由于蘆薈凝膠中的多糖、酚類化合物和銀杏葉中的黃酮類化合物可以捕捉和清除 O2-·、·OH、H2O2、烷類自由基和脂類自由基等，通過對這些自由基起一種氫原子供體的作用而終止自由基連鎖反應(yīng)鏈，從而阻止和抑制氧自由基反應(yīng)和脂質(zhì)、蛋白質(zhì)過氧化反應(yīng)，抑制LPO及其代謝產(chǎn)物丙二醛、共軛二烯等活性毒副物質(zhì)的生成，抑制蛋白質(zhì)羰基生成[4-6]。同時(shí)，酚類、黃酮類化合物還可參與調(diào)節(jié)和提高SOD、GSH-PX等抗氧化酶的活性[16-17]，從而發(fā)揮抗氧化功效。

[1]萬金志,喬悅昕.蘆薈的化學(xué)成分及其研究[J].中草藥,1999,30(2):151-153

[2]梁立興.中國銀杏[M].濟(jì)南：山東科學(xué)技術(shù)出版社,1988：2

[3]張麗嬌,費(fèi)瑞,高立宏,等.銀杏多糖的生物活性研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(32):16185-16186,16192

[4]Torel J,Cillard J,Cillard P.Antioxidant activity of flavonoids and reactivity with peroxy radical[J].Phytochemistry,1986,25(2):383

[5]王曉東,趙軍寧.中藥抗氧化作用研究進(jìn)展[J].中藥藥理與臨床,1990,6(2):41

[6]楊義芳,吳國友.銀杏葉藥理研究概況[J].現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),1995：12(6):5

[7]中華人民共和國衛(wèi)生部.保健食品功能學(xué)評價(jià)程序和檢驗(yàn)方法[M].北京：中華人民共和國衛(wèi)生部,2012

[8]龔國清.小鼠衰老模型研究[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào),1991,22(2):101-103

[9]徐智,吳國明,錢桂生,等.大鼠衰老模型的初步建立[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,25(4):312-315

[10]劉榮,董強(qiáng),王向宏.柳蒿芽黃酮抗氧化作用的研究[J].食品工業(yè)科技,2010,31(12):319-321

[11]康樺,匡榮.α-硫辛酸抗D-半乳糖所致小鼠衰老作用研究[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2008,27(8):896-898

[12]LI Xiuxia,HAN Lujia,CHEN Longjian.in vitro Antioxidant activity of protein hydrolysates prepared from corn gluten meal[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,2008,88(9):1660-1666

[13]CHANPUT W,THEERAKULKAIT C,NAKAI S.Antioxidative properties of partially purified barley hordein,rice bran protein fractions and their hydrolysates[J].Journal of Cereal Science,2009,49(3):422-428

[14]LI Yanhong,JIANG Bo,ZHANG Tao,et al.Antioxidant and free radical-scavenging activities of chickpea protein hydrolysate(CPH）[J].Food chemistry,2008,106:444-450

[15]ZHU Kexue,ZHOU Huiming,QIAN Haifeng.Antioxidant and free radical-scavenging activities of wheat germprotein hydrolysates(WGPH）prepared with alcalase[J].Process biochemistry,2006,41(6):1296-1302

[16]陳瑗,周玫.自由基醫(yī)學(xué)[M].北京：人民軍醫(yī)出版,1991：64-184

[17]句海松,忻文娟,李小潔,等.甘草類黃酮對脂質(zhì)過氧化和活性氧自由基的作用[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),1989,24(11):807