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    ADAMTS-4與TAK1在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中表達(dá)的相關(guān)性研究

    2014-07-25 11:21:48張琪琪闕玉康
    關(guān)鍵詞:免疫組化軟骨細(xì)胞因子

    張琪琪,胡 勇,周 定,丁 輝,闕玉康,魏 偉

    骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種進(jìn)行性關(guān)節(jié)軟骨退變性疾病,其病理特征為關(guān)節(jié)軟骨破壞和關(guān)節(jié)周圍骨贅的形成。聚蛋白多糖的丟失引起軟骨細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)合成與分解代謝的失衡是OA軟骨破壞的重要機(jī)制之一[1]。近年來研究[2]顯示ADAMTS-4,即帶有血小板凝血酶敏感蛋白樣模體的解整鏈蛋白金屬蛋白酶-4,在人OA的聚蛋白多糖的降解中起著主要作用。許多信號通路參與OA的發(fā)病過程,這些信號通路通過級聯(lián)放大作用,導(dǎo)致ECM中相關(guān)蛋白酶及炎性成分變化引起軟骨破壞;其中絲裂原活性蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPKs)途徑和核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)途徑在 OA 發(fā)病中發(fā)揮重要作用[3]。轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1(mitogen-activated protein kinase,TAK1)是 MAP3K 家族的成員之一,其處于這兩條信號通路的上游分支點(diǎn)上,可被多種促炎性細(xì)胞因子激活[4]。該研究旨在探討ADAMTS-4、TAK1在OA和正常軟骨中的表達(dá)情況,了解二者在OA軟骨中的發(fā)病作用及相互關(guān)系,探討OA發(fā)病機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 研究對象 收集2012年8月~2013年4月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科二病區(qū)的住院患者。①OA組:因膝骨關(guān)節(jié)炎而行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)中取材的關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本,共20例(男5例,女15例),年齡49~82(65.9±9.22)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):OA患者診斷符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)2001年推薦的膝關(guān)節(jié)OA診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。② 正常對照組:因股骨頸骨折而行全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)或者因急性外傷致下肢截肢術(shù)中取材的軟骨標(biāo)本,共10例(男3例,女7例),年齡52~76(64.2±9.44)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):術(shù)前X線檢查關(guān)節(jié)軟骨面光滑,并術(shù)后病理學(xué)診斷關(guān)節(jié)無病變。所有新鮮標(biāo)本一部分以10%中性福爾馬林液固定,另外一部分標(biāo)本離體后置于生理鹽水的標(biāo)本盒中,迅速轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 試劑與儀器 兔抗ADAMTS-4多克隆抗體(英國Abcam公司);兔抗TAK1多克隆抗體(美國Santa Cruz公司);Elivision免疫組化兩步法檢測試劑盒(福建邁新公司);RIPA組織裂解液和SDSPAGE加樣緩沖液(中國碧云天生物技術(shù)研究所);山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);ECL顯影液(美國Thermo公司);Bioshine ChemiQ4600熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(中國Bioshine公司);Motic BA600 Mot-7.5型自動顯微鏡(中國Motic公司)。

    1.3 免疫組織化學(xué)檢測ADAMTS-4、TAK1表達(dá)及分布特點(diǎn)

    1.3.1 免疫組化步驟 福爾馬林固定后的關(guān)節(jié)軟骨經(jīng)10%EDTA脫鈣后,常規(guī)脫水,石蠟包埋,以3~4 μm厚度連續(xù)切片,制備HE及免疫組化切片。其中免疫組化操作步驟如下:65℃烤箱烤24 h,二甲苯、梯度乙醇脫蠟水化;胰酶37℃下行抗原修復(fù)30 min,滴加內(nèi)源性過氧化物阻滯劑過氧化氫(H2O2)、分別滴加一抗(ADAMTS-4稀釋濃度為1∶200,TAK1稀釋濃度為1∶300),4℃冰箱過夜;滴加生物素標(biāo)記的二抗,DAB顯色,蘇木精復(fù)染,乙醇脫水,二甲苯透明,封片,鏡下觀察。

    1.3.2 免疫組化結(jié)果判斷 使用 Motic BA600 Mot-7.5型自動顯微鏡對各組免疫組化結(jié)果進(jìn)行掃描拍照,再采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對各免疫組化結(jié)果圖片進(jìn)行積分光密度(integral optical density,IOD)檢測和分析。每張切片隨機(jī)選取5個高倍鏡視野(×200),選取細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色顆粒的軟骨細(xì)胞為陽性結(jié)果進(jìn)行標(biāo)記,以此自動檢測所有視野的陽性結(jié)果。以參數(shù)平均積分光密度(integrated optical density average,IA)代表蛋白的顆粒密度。

    1.4 Western blot法檢測軟骨中 ADAMTS-4、TAK1表達(dá) 在冰浴條件下,0.05 g軟骨組織在499 μl RIPA組織裂解液、1 μl苯甲磺酰氟中研磨、裂解30 min。將裂解液移至1.5 ml EP管中,14 000 r/min 離心15 min,取上清液 100 μl,加入 25 μl 5 ×SDS上樣緩沖液,煮沸10 min,用10%的SDS-PAGE凝膠電泳2 h,蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂牛奶37℃封閉1.5 h,加入兔抗 ADAMTS-4一抗(1∶200)、兔抗TAK1一抗(1∶300)及鼠抗β-actin一抗(1∶500)孵育,4℃過夜,加入山羊抗兔標(biāo)記二抗(1∶40 000)、山羊抗鼠標(biāo)記二抗(1∶50 000)孵育2 h,TPBS清洗3次及PBS清洗1次后加ECL液顯影,掃描儀中成像。運(yùn)用Image J軟件分析各組Western blot條帶計算灰度值。以β-actin蛋白的灰度值為內(nèi)參,計算二者比值即為灰度值比值。

    1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)分析結(jié)果以±s表示,組間均數(shù)比較采用t檢驗,兩種指標(biāo)之間的關(guān)系采用Spearman秩相關(guān)性分析。

    2 結(jié)果

    2.1ADAMTS-4和TAK1在軟骨組織中的表達(dá)HE染色結(jié)果顯示:正常對照組軟骨表面光滑,軟骨細(xì)胞位于軟骨陷窩內(nèi),逐層呈規(guī)則排列。而OA組軟骨表面不平整,有裂隙,軟骨細(xì)胞排列紊亂,外形不規(guī)則,可見簇集的軟骨細(xì)胞和退變肥大的軟骨細(xì)胞。免疫組化結(jié)果顯示:在OA軟骨組織中,ADAMTS-4主要表達(dá)于軟骨細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi),可見大量棕黃色顆粒,細(xì)胞膜黃染,特別是固縮退變的軟骨細(xì)胞更明顯。而正常對照組陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少,其表達(dá)量較低,二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.81,P<0.01)。TAK1在OA軟骨細(xì)胞、一些炎性細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá),細(xì)胞內(nèi)可見棕黃色顆粒。在正常對照組軟骨的分布部位與OA組相似,但數(shù)量明顯減少,染色強(qiáng)度明顯降低,二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.58,P <0.01)。見圖1、2 和表1。

    圖1 正常對照組和OA組軟骨HE染色結(jié)果 HE×200

    圖2 正常對照組和OA組軟骨中ADAMTS-4和TAK1的表達(dá) Elivision×200

    表1 ADAMTS-4和TAK1在正常對照組及OA組軟骨中的表達(dá)(IA,±s)

    表1 ADAMTS-4和TAK1在正常對照組及OA組軟骨中的表達(dá)(IA,±s)

    與正常對照組比較:**P<0.01

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    Western blot法結(jié)果提示:OA患者軟骨組織中ADAMTS-4表達(dá)高于正常對照組,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,OA組與正常對照組灰度值比值比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.27,P<0.01);TAK1在OA軟骨組織中表達(dá)也高于正常對照組,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,兩組灰度值比值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.25,P<0.01)。部分OA組和正常對照組電泳結(jié)果見圖3。

    圖3 Western blot法檢測ADAMTS-4和TAK1在正常對照組及OA組軟骨中的表達(dá)

    2.2ADAMTS-4和TAK1在OA軟骨組織中表達(dá)的相關(guān)性分析 OA軟骨中ADAMTS-4及TAK1的IA值明顯高于正常對照組(P<0.01)。20例OA患者軟骨組織中,TAK1陽性表達(dá)的IA值為0.30±0.11,ADAMTS-4陽性表達(dá)的IA值為0.42±0.12,經(jīng)相關(guān)分析結(jié)果表明,在OA軟骨組織中TAK1和ADAMTS-4的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.469,P<0.05)。見表1。

    3 討論

    多因素造成ECM構(gòu)成成分的改變引起關(guān)節(jié)軟骨的退變及破壞是OA發(fā)病機(jī)制之一。而ECM主要由膠原纖維和聚蛋白多糖構(gòu)成。有文獻(xiàn)[1]報道,聚蛋白多糖使關(guān)節(jié)軟骨具有很好的彈性和抗壓性,聚蛋白多糖的丟失被認(rèn)為在OA的發(fā)病中起著重要的啟動作用。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)能夠特異性的降解關(guān)節(jié)軟骨ECM中的Ⅱ型膠原、彈力纖維等,長期以來被認(rèn)為在OA進(jìn)展中起著重要作用[6];隨著對OA發(fā)病機(jī)制的深入研究,發(fā)現(xiàn)早期引起軟骨降解的酶是聚蛋白多糖酶,而MMPs在晚期才起作用。其中ADAMTS-4是被廣泛認(rèn)可,具有強(qiáng)大的聚蛋白多糖降解能力[7]。ADAMTS-4主要通過作用于軟骨蛋白聚糖核心蛋白球間區(qū)(IGD)的蛋白水解分裂位點(diǎn)Glu373-Ala374發(fā)揮作用。有研究[8]顯示,正常者和OA患者的軟骨組織中均有ADAMTS-4表達(dá),且在OA軟骨組織中表達(dá)明顯增多,此外ADAMTS-4與關(guān)節(jié)軟骨破壞的程度有直接的關(guān)系,因此認(rèn)為ADAMTS-4是引起人OA軟骨降解的主要聚蛋白多糖酶。本研究結(jié)果表明ADAMTS-4在OA組較正常對照組高表達(dá),陽性細(xì)胞主要分布于關(guān)節(jié)軟骨淺層及中層退變軟骨細(xì)胞中;提示ADAMTS-4在OA的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。通過特異性抑制ADAMTS-4能夠有效控制OA的病情進(jìn)展。

    在OA病程中,白細(xì)胞介素1(interleukin-1,IL-1)、IL-6、IL-17、IL-18、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等是參與關(guān)節(jié)病變的主要促炎性細(xì)胞因子[9]。這些促炎性細(xì)胞因子主要是通過多條細(xì)胞內(nèi)信號通路的級聯(lián)放大作用導(dǎo)致蛋白酶、前炎癥因子變化,使軟骨ECM分解代謝超過合成代謝,引起關(guān)節(jié)軟骨破壞。而在眾多的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中,MAPKs信號通路和NF-κB信號通路在OA發(fā)生發(fā)展中起了很重要的作用。Lea et al[10]研究發(fā)現(xiàn) TAK1 是 MAPKs信號通路和骨形態(tài)蛋白(BMP)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子并且在骨和關(guān)節(jié)發(fā)育中起著一定作用。TAK1可被上述多種促炎性細(xì)胞因子應(yīng)激信號刺激所激活。在MAPKs信號通路中,激活的TAK1通過MEKK3/6、MEKK4/7調(diào)節(jié)JNK和p38蛋白激酶的活性,最終活化核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1(AP-1),從而引起靶基因的表達(dá);而在NF-κB信號通路中,活化的TAK1激活NF-κB誘導(dǎo)激酶(NIK)和 IKB激酶(IKK),進(jìn)而磷酸化IκB介導(dǎo)NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),影響目的基因的表達(dá)。

    研究[11-14]顯示在人軟骨細(xì)胞內(nèi),NF-κB 和MAPKs可以上調(diào)由TNF-α或IL-1β介導(dǎo)的MMP-1、MMP-13、ADAMTS-4基因和蛋白的表達(dá),抑制MAPK-ERK1/2活性可以降低ADAMTs和MMPs的高表達(dá)。Klatt et al[15]研究發(fā)現(xiàn)在OA軟骨細(xì)胞中TAK1有一定的表達(dá),抑制TAK1基因可以減少下游炎性細(xì)胞因子及相關(guān)蛋白酶的表達(dá),TAK1對AP-1及NF-κB的活性起著更關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果顯示,20例OA患者TAK1表達(dá)明顯高于正常對照組,且發(fā)現(xiàn)淺層軟骨細(xì)胞呈陽性反應(yīng)較多,而深層軟骨細(xì)胞只有少數(shù)呈陽性反應(yīng)或者未見陽性細(xì)胞。由此可以推斷,TAK1作為炎癥反應(yīng)中MAPKs細(xì)胞信號通路和NF-κB信號通路上游重要的激酶,在OA發(fā)病中可能起著重要作用。

    本研究對OA軟骨組織中的ADAMTS-4和TAK1的表達(dá)進(jìn)行了相關(guān)性分析,初步證實(shí)兩者呈正相關(guān),提示ADAMTS-4與TAK1在OA軟骨病變的發(fā)生發(fā)展中具有協(xié)同作用,這可能與活化的TAK1具有調(diào)節(jié)ADAMTS-4表達(dá)作用有關(guān)。通過干預(yù)上游信號分子TAK1的活性,將有助于減少相關(guān)炎性細(xì)胞因子和蛋白酶類等對OA病理生理的影響,因此TAK1可以作為OA治療的新靶點(diǎn),為OA的治療提供新的思路。

    綜上所述,軟骨組織中ADAMTS-4和TAK1的高表達(dá)與OA的發(fā)生發(fā)展有關(guān),活化的TAK1可能致OA軟骨中ADAMTS-4的高表達(dá)。但ADAMTS-4和TAK1之間具體的相互作用機(jī)制尚不清楚,且OA是多因素作用的結(jié)果,有待進(jìn)一步研究。

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