安徽省漢族人群Miltenberger血型調(diào)查分析

周 娟，呂 蓉，朱幫強(qiáng)，韓婷婷，劉 忠，4

MNS血型系統(tǒng)是第2個(gè)被發(fā)現(xiàn)的血型系統(tǒng)，其復(fù)雜程度僅次于Rh血型系統(tǒng)［1］。MNS系統(tǒng)包括一些變異的低頻率抗原，這些抗原聯(lián)系在一起組成Miltenberger血型系統(tǒng)，其中Mur抗原是該血型系統(tǒng)中最常見(jiàn)的一種抗原，在中國(guó)人中具有相對(duì)較高的頻率。Miltenberger血型系統(tǒng)在輸血醫(yī)學(xué)中具有重要意義。有報(bào)道［2－3］表明，抗Mur抗體能引起嚴(yán)重的溶血性輸血反應(yīng)及新生兒溶血病，因此，對(duì)中國(guó)人群Miltenberger血型分布進(jìn)行調(diào)查，評(píng)估因Miltenberger血型不配合引起輸血反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，有一定的臨床意義。該研究采用序列特異性引物PCR(PCRSSP)法對(duì)安徽省2 660例漢族人群Miltenberger血型進(jìn)行了檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 樣本 隨機(jī)選取安徽省血液中心2 660例非血緣關(guān)系的漢族無(wú)償志愿獻(xiàn)血者，經(jīng)外周靜脈采血5 ml并用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)本和血清:Mur抗原陽(yáng)性標(biāo)本6份、陰性標(biāo)本2份以及抗-Mur標(biāo)準(zhǔn)血清1份，均由中山市紅十字中心血站提供。

1.2 主要試劑與儀器 ① PCR試劑:血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司，批號(hào):M1218);dNTPs(批號(hào):CBH801A)、DL2000 Marker(批號(hào):B7001A)(大連TaKaRa公司);SYBR Green I核苷酸膠體染料(美國(guó) Invitrogen公司，批號(hào):416154);MgCl2、10 × PCR Buffer、AmpliTaq 金牌酶 (美 國(guó) ABI公 司，批 號(hào):R01012、R02959、R04816);測(cè)序反應(yīng)及純化試劑:ExoSAP-1T蝦堿磷酸酶(美國(guó)Promega公司);BigDye V3.1測(cè)序試劑盒(美國(guó)ABI公司);② 主要儀器:Biophotometer型DNA濃度測(cè)定儀(德國(guó)Eppendorf公司);PCT-200 PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)MJ Research公司);PRISM 3730測(cè)序儀(美國(guó)ABI公司)。

1.3 引物 按照文獻(xiàn)［4］設(shè)計(jì)并委托上海英俊生物技術(shù)公司合成包括GYP.Mur基因在內(nèi)的序列特異性引物，測(cè)序引物同擴(kuò)增引物?？梢詸z測(cè)到Miltenberger血型系統(tǒng)的表型有 GP.Mur、GP.Hop、GP.Bun、GP.Hut、GP.HF，人類生長(zhǎng)激素(HGH)基因引物作為對(duì)照，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度

1.4 基因組DNA提取 采用離心柱法，使用天根血液基因組提取試劑盒從EDTA抗凝血中提取基因組DNA，并通過(guò)DNA濃度測(cè)定儀對(duì)其濃度、純度進(jìn)行測(cè)定。

1.5 PCR-SSP法檢測(cè)Miltenberger血型系統(tǒng) ①PCR 擴(kuò)增體系:反應(yīng)總體積為 50 μl，其中含 2 μl模板 DNA，5 μl 10 × PCR Buffer，1.5 mmol/L MgCl2，0.1 mmol/L dNTPs，10 μmol/L 引物各 1 μl，Ampli-Taq金牌酶0.75 U。②PCR擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性15 min;然后94℃變性20 s，65℃退火20 s，72℃延伸20 s，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。③ 產(chǎn)物分析:取擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl與已加SYBR Green染料的6×Loading Buffer 2 μl混合，直接點(diǎn)樣至2%瓊脂糖凝膠(不含EB)，95 V電泳30 min，用凝膠成像儀觀察結(jié)果并作出判斷。

1.6 Mur血型血清學(xué)鑒定 采用鹽水法，抗-Mur標(biāo)準(zhǔn)血清2滴，加3% ～5%PCR-SSP陽(yáng)性標(biāo)本的紅細(xì)胞1滴，混勻，3 000 r/min離心18 s。若鹽水法無(wú)凝集，再做凝聚胺法進(jìn)一步加強(qiáng)，并觀察結(jié)果。

1.7 測(cè)序驗(yàn)證 ① PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化:在每5 μl PCR產(chǎn)物中加入2 μl ExoSAP-1T蝦堿磷酸酶，消化條件為37℃ 30 min，80℃ 15 min，然后冷卻至4℃。②PCR純化產(chǎn)物的直接測(cè)序:PCR純化產(chǎn)物為測(cè)序反應(yīng)模板，使用BigDye V3.1測(cè)序試劑盒進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序引物即擴(kuò)增引物;采用醋酸鈉/乙醇法純化測(cè)序PCR產(chǎn)物，取純化產(chǎn)物上測(cè)序儀進(jìn)行電泳測(cè)序，Sequencing Analysis軟件進(jìn)行序列分析。

2 結(jié)果

2.1 PCR-SSP檢測(cè)Miltenberger血型系統(tǒng) 采用PCR-SSP法對(duì)2 660份獻(xiàn)血者樣本進(jìn)行篩查，有24份陽(yáng)性(0.9%)。擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 PCR-SSP產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 血清學(xué)試驗(yàn)驗(yàn)證 鹽水法檢測(cè)PCR-SSP陽(yáng)性標(biāo)本的紅細(xì)胞均與抗-Mur標(biāo)準(zhǔn)血清發(fā)生凝集反應(yīng)，表明存在Mur抗原。

2.3 基因測(cè)序結(jié)果分析 應(yīng)用特異性引物對(duì)24例陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中Miltenberger血型系統(tǒng)基因參照序列比較，結(jié)果與GenBank的JN201202序列(即GP.Mur序列)一致(圖2)，表明這24例標(biāo)本均為GP.Mur表型。

圖2 陽(yáng)性標(biāo)本的測(cè)序情況

3 討論

Miltenberger血型系統(tǒng)中Mur抗原的臨床意義最大，而其在不同種族中的分布差異較大，在人類學(xué)研究中也是一個(gè)有用的工具。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示安徽省漢族人群GP.Mur表型頻率為0.9%。GP.Mur表型在東南亞人群中有較高的頻率，泰國(guó)人為9.7%，臺(tái)灣一般人群平均頻率為7.3%［5］。Mur抗原在我國(guó)不同地區(qū)的漢族人群中的頻率分布有差異，在廣州番禺地區(qū)的頻率為7.16%［6］，上海市的頻率為0.67%［7］。Mur抗原在我國(guó)一些少數(shù)民族地區(qū)的分布頻率更高，調(diào)查發(fā)現(xiàn)在云南怒族的頻率高達(dá)22.65%［8］，廣西侗族、壯族分別占15.4%［9］和11.29%［10］。

Miltenberger血型系統(tǒng)存在11個(gè)低頻抗原，即Mia、Vw、Hut、Mur、MUT、Hil、TSEN、MINY、Hop、Nob和DANE，這些抗原交叉組成11種不同表型，即GP.Vw、GP.Hut、GP.Mur、GP.Hop、GP.Hil、GP.Bun、GP.Nob、GP.Joh、GP.Dane、GP.HF 以及 GP.JL。Miltenberger血型系統(tǒng)產(chǎn)生的機(jī)制為血型糖蛋白A(GPA)和血型糖蛋白B(GPB)的基因發(fā)生重組，即GYP(A－B)、GYP(A－B－A)、GYP(B－AB)雜交基因所致，其編碼基因GYPA、GYPB位于染色體4q28 －31［11］。GYP(A －B)雜交基因編碼 GP.Hil和 GP.JL［12］。對(duì)于 GYP.Hil、GYPA 與 GYPB 的交換位點(diǎn)位于GYPA內(nèi)含子3的5'端，而GYP.JL交換位點(diǎn)位于內(nèi)含子3的3'端，并包括GYPB外顯子4的 7 個(gè)核苷酸。GP.Vw、GP.Hut、GP.Nob、GP.Joh以及GP.Dane都是由GYP(A－B－A)雜交基因所編碼［12］。在這些雜交基因中，GYPB假外顯子不同大小(1～16 bp)的插入片段替換了相同數(shù)目GYPA外顯子3的核苷酸。GYP(B－A－B)雜交基因所編碼 GP.Mur、GP.Hop、GP.Bun 以及 GP.HF［12］。在這些雜交基因中，通常沉默的GYPB假外顯子3表達(dá)。在亞洲人群中，Mur抗原是其中最常見(jiàn)的一種抗原。該抗原是由于GYPB的假外顯子3的部分片段被同源GYPA的外顯子3替代，從而形成GYP(B－AB)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致外顯子3的剪切位點(diǎn)被激活而表達(dá)Mur抗原，其特異的氨基酸序列為(34TPAHANE41)［13］。

由于Mur抗原在臍帶血中有很好的表達(dá)，易引起新生兒溶血病，也可引起嚴(yán)重的輸血反應(yīng)。因此，在輸血反應(yīng)原因分析時(shí)應(yīng)考慮Mur抗原抗體反應(yīng)。Miltenberger血型的分布和獻(xiàn)血者資料是建立當(dāng)?shù)丶t細(xì)胞庫(kù)的前提。此外，Mur抗原在安徽省的頻率較高，輸入這種血型的血液是否產(chǎn)生抗體，需要后續(xù)的進(jìn)一步研究來(lái)證實(shí)。

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