LY294002靶向抑制PI3K/Akt信號(hào)通路干預(yù)K562細(xì)胞增殖的研究

耿英華，武文娟，于北凱，夏瑞祥

Akt是一類調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡與存活的胞質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，生理狀態(tài)下，Akt以低活性存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)各種因素刺激時(shí)，Akt在PI3K作用下發(fā)生磷酸化而激活［1］?；罨腁kt可促進(jìn)細(xì)胞的生存、增殖、轉(zhuǎn)移以及血管的形成。研究［2－3］表明，Akt在人類多種腫瘤中常被過度活化，如在胃腸道腫瘤、胰腺癌等組織中均高表達(dá)及活化。腫瘤細(xì)胞中Akt的活化與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡密切相關(guān)。Akt磷酸化可被PI3K特異性抑制劑LY294002［4］所抑制。該研究以慢性髓系白血病細(xì)胞株K562為研究對(duì)象，觀察LY294002對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響并探討其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人慢性髓系白血病細(xì)胞株K562由蚌埠醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)實(shí)驗(yàn)中心凍存。培養(yǎng)條件:含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，同時(shí)加入100 U/L鏈霉素和100 U/L青霉素，于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d傳代1次。實(shí)驗(yàn)時(shí)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞。

1.2 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司);MTT、DMSO(美國Sigma公司);總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、PCR試劑盒、DNA Marker(北京天根生化科技有限公司);LY294002、PI單染周期檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);Skp2、GAPDH引物(南京金斯瑞生物科技有限公司);β-actin、Skp2鼠抗人單克隆抗體、山羊抗小鼠二抗(美國Santa Cruz公司);細(xì)胞培養(yǎng)板(美國Corning公司)。

1.3 MTT比色法測定 取對(duì)數(shù)生長期K562細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×104/ml，每孔100 μl種植于96孔培養(yǎng)板中。實(shí)驗(yàn)組LY294002終濃度分別為2.5、5、10、20、40、60 μmol/L，每個(gè)濃度設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組和空白調(diào)零組，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24、48 h后，每孔加MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，繼續(xù)孵育 4 h 后終止培養(yǎng)，加 DMSO 150 μl/孔，室溫振搖10 min后，于波長570 nm處讀取吸光度(OD)值。取3孔OD值的均數(shù)按公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1－OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組)×100%

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 常規(guī)培養(yǎng)K562細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×104/ml，2 ml每孔接種于6孔培養(yǎng)板，分對(duì)照組、LY294002終濃度為10、20 μmol/L的實(shí)驗(yàn)組。用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)36 h，收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌1次，離心去除PBS，加入預(yù)冷的70%乙醇溶液固定細(xì)胞12～24 h，離心棄去固定液，PBS洗滌1次后收集細(xì)胞于流式管，每管細(xì)胞樣品中加入預(yù)先配置好的含有RNase A和PI的染色液0.5 ml，緩慢并充分重懸細(xì)胞，37℃避光孵育30 min，隨后冰浴放置并用BD流式細(xì)胞儀在488 nm激發(fā)波長下檢測紅色熒光和光散射情況，F(xiàn)lowjo軟件分析細(xì)胞周期。

1.5 RT-PCR法檢測Skp2 mRNA表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長期 K562細(xì)胞接種于6孔板，分對(duì)照組、LY294002終濃度為10、20 μmol/L的實(shí)驗(yàn)組。用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)36 h，收集細(xì)胞。按照試劑盒說明提取總RNA，檢測RNA提取純度及濃度，每組取2 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并對(duì)各組細(xì)胞的目的基因Skp2和內(nèi)參基因GAPDH進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，32個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，BIO-RAD凝膠成像儀檢測條帶并分析灰度值，計(jì)算各組Skp2 mRNA相對(duì)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。見表1。

表1 待測基因的PCR引物序列及擴(kuò)增片段長度

1.6 Western blot法檢測Skp2蛋白表達(dá)的變化取對(duì)數(shù)生長期K562細(xì)胞接種于6孔板，分對(duì)照組、LY294002終濃度為 10、20 μmol/L的實(shí)驗(yàn)組，培養(yǎng)36 h后收集細(xì)胞，加蛋白裂解液冰上裂解30 min，采用BCA法對(duì)各組蛋白進(jìn)行定量檢測。每組取25 μg蛋白，10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，封閉液室溫封閉3 h;小鼠抗人Skp2一抗按1∶1 000稀釋，小鼠抗人β-actin一抗按1∶3 000稀釋，4℃搖床上孵育過夜;TBST洗膜10 min，重復(fù)3次;山羊抗小鼠二抗按1∶5 000稀釋，37℃孵育2 h;TBST洗膜10 min，重復(fù)3次;最后用ECL發(fā)光試劑盒顯影;BIO-RAD凝膠成像儀檢測條帶并進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算各組Skp2蛋白相對(duì)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，各處理組間差異采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法。

2 結(jié)果

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測LY294002作用K562細(xì)胞36 h后各組細(xì)胞周期分布情況

2.1 不同濃度LY294002對(duì)K562細(xì)胞增殖抑制作用 MTT法檢測各組細(xì)胞的增殖抑制率的結(jié)果表明:不同濃度LY294002對(duì)K562細(xì)胞的增殖均有抑制作用，在相同作用時(shí)間下，增殖抑制作用與LY294002濃度呈正比關(guān)系，濃度越高，抑制作用越強(qiáng);在同一濃度下，LY294002作用時(shí)間越長，細(xì)胞增殖抑制率越高，表現(xiàn)出時(shí)間-劑量依賴性，見表2。

2.2 LY294002對(duì)細(xì)胞周期的影響 LY294002作用于K562細(xì)胞36 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明:LY294002能顯著改變G0/G1與S期細(xì)胞的比例。與對(duì)照組相比，隨著LY294002濃度的升高，S期細(xì)胞比例逐漸減少，G0/G1期細(xì)胞則呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，G2/M期細(xì)胞沒有顯著變化(P＞0.05)。見圖1、表3。

表2 不同濃度LY294002作用不同時(shí)間后K562細(xì)胞的增殖抑制率(n=3，±s)

表2 不同濃度LY294002作用不同時(shí)間后K562細(xì)胞的增殖抑制率(n=3，±s)

與對(duì)照組(0 μmol/L LY294002)比較:*P＜0.05;與同一濃度的24 h實(shí)驗(yàn)組比較:#P＜0.05

?

表3 LY294002對(duì)K562細(xì)胞周期分布的影響(%，±s)

表3 LY294002對(duì)K562細(xì)胞周期分布的影響(%，±s)

與對(duì)照組(0 μmol/L LY294002)相比:*P ＜0.05;與 10 μmol/L LY294002組比較:#P＜0.05

?

2.3 LY294002對(duì)Skp2 mRNA表達(dá)的影響 RTPCR法結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，10、20 μmol/L LY294002作用K562細(xì)胞36 h后，Skp2 mRNA的表達(dá)受影響，相對(duì)表達(dá)量分別為0.367±0.035、0.242±0.025，與對(duì)照組(0.476±0.027)相比，表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖2。

圖2 LY294002作用于K562細(xì)胞36 h后Skp2 mRNA的表達(dá)變化

2.4 LY294002對(duì)Skp2蛋白表達(dá)的影響 Western blot法結(jié)果表明，經(jīng)LY294002作用36 h后，Skp2蛋白的表達(dá)量顯著降低，10、20 μmol/L LY294002實(shí)驗(yàn)組Skp2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.528±0.091和0.349±0.067，與對(duì)照組(0.695±0.077)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖3。

圖3 LY294002作用于K562細(xì)胞36 h后Skp2蛋白的表達(dá)

3 討論

白血病是一類造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，是最常見的血液系統(tǒng)惡性疾病。當(dāng)前臨床使用的治療藥物多數(shù)為細(xì)胞毒類藥物，此類藥物一般抑制細(xì)胞的DNA和蛋白質(zhì)合成等基本機(jī)能，所以對(duì)正常細(xì)胞也有毒性，從而引起一系列的毒副作用等。20世紀(jì)末以來，分子靶向抗癌藥物成為腫瘤治療研究最活躍的領(lǐng)域之一。此類藥物一般作用于腫瘤細(xì)胞的特定分子靶點(diǎn)，利用腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞在基因、酶、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面的異常，選擇性抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物行為，從而產(chǎn)生抗腫瘤作用，而對(duì)正常細(xì)胞的副作用較小。因此分子靶向抗癌藥物很少產(chǎn)生傳統(tǒng)化療的毒副作用。

PI3K為一類脂激酶，主要催化磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PIP2)磷酸化形成磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸(PIP3)，繼而激活下游的Akt(蛋白激酶B)等促進(jìn)細(xì)胞的生存、增殖、轉(zhuǎn)移以及血管生成。生理狀態(tài)下，Akt以低活性存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)各種因素刺激時(shí)，Akt在PI3K作用下發(fā)生磷酸化而激活。PI3K/Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化，避免細(xì)胞發(fā)生凋亡，此信號(hào)通路作為細(xì)胞生長增殖的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在維持細(xì)胞惡性生物學(xué)特性中起重要作用［5］。因此抑制該信號(hào)通路成為腫瘤治療靶點(diǎn)之一。LY294002改造自槲皮素，是經(jīng)典的PI3K抑制劑，其可以在上游非特異性地阻斷 PI3K/Akt信號(hào)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［6－7］。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)LY294002體外作用K562細(xì)胞后，細(xì)胞增殖抑制率隨著作用時(shí)間和作用濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，為明確LY294002抑制白血病細(xì)胞增殖的機(jī)制，本研究選取36 h這個(gè)時(shí)間點(diǎn)通過細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)和檢測細(xì)胞周期中重要的調(diào)節(jié)因子Skp2做進(jìn)一步的探究。細(xì)胞周期調(diào)控與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，在細(xì)胞周期調(diào)控中其增殖的速度是由G1期的長短決定的，當(dāng)處于G0/G1細(xì)胞越多，S期細(xì)胞越少時(shí)細(xì)胞的增殖速度就會(huì)越低，這也是很多抗腫瘤藥物抑制腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制之一，該研究顯示在不同濃度LY294002作用下，S期細(xì)胞比例減少，G0/G1期細(xì)胞增加，即表現(xiàn)為細(xì)胞被阻滯于G0/G1期，且這種阻滯效應(yīng)隨著LY294002濃度的升高而更加明顯，而G2/M期變化不大。這與李燾等［8］在腦膠質(zhì)瘤 U87細(xì)胞株的研究結(jié)果相近。因此可以認(rèn)為LY294002的使用產(chǎn)生了周期阻滯，抑制了K562細(xì)胞的增殖過程。

Skp2是細(xì)胞周期中重要的調(diào)節(jié)因子，能特異性識(shí)別磷酸化底物并介導(dǎo)其泛素化降解，許多細(xì)胞周期調(diào)控因子如p27、P21、cyclinE、cyclinD 和C-myc等都是Skp2依賴性泛素蛋白酶體途徑底物。研究［9-11］表明，Skp2能夠負(fù)調(diào)控細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子p27，下調(diào)的p27能夠使細(xì)胞順利通過G1-S期調(diào)控點(diǎn)，完成G1→S期的轉(zhuǎn)變。Skp2在腫瘤細(xì)胞中異常高表達(dá)，與多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［12］。Skp2的表達(dá)降低能夠抑制腫瘤細(xì)胞的周期轉(zhuǎn)換，從而影響腫瘤細(xì)胞增殖［13］。本研究結(jié)果表明LY294002作用K562細(xì)胞36 h后Skp2 mRNA和Skp2蛋白水平隨藥物濃度增加而顯著下降，使細(xì)胞周期不能順利通過G1-S期的調(diào)控點(diǎn)，阻滯在G0/G1期，S期細(xì)胞減少。由此推測，阻斷PI3K/Akt通路的抗腫瘤細(xì)胞增殖效應(yīng)可能是通過下調(diào)Skp2的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，LY294002能夠通過抑制Skp2的表達(dá)，使K562細(xì)胞的生長周期受影響，無法順利通過G1-S期限制點(diǎn)，形成G0/G1期阻滯，從而抑制K562細(xì)胞的增殖，為PI3K/Akt信號(hào)通路成為白血病治療靶點(diǎn)奠定理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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