CD59a在激光誘導小鼠脈絡膜新生血管形成中的作用△

許琴 金濤 林素香 王雅麗 肖煜晨

CD59a在激光誘導小鼠脈絡膜新生血管形成中的作用△

許琴 金濤 林素香 王雅麗 肖煜晨

CD59a;脈絡膜新生血管;黃斑變性

目的探討補體調節(jié)蛋白CD59a在激光誘導小鼠脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)形成中的作用。方法實驗分3組：C57BL/6小鼠對照組、CD59a(-/-)小鼠組、rsCD59a-FC預處理小鼠組。氪紅激光光凝誘導小鼠CNV模型，觀察上皮-脈絡膜-鞏膜復合物CNV的發(fā)生率；免疫組化檢測膜攻擊復合物沉積；RT-PCR檢測CD59a mRNA表達。結果C57BL/6小鼠對照組在光凝后第3天、第5天見CD59a mRNA表達下調，分別為60%、30%。CD59a(-/-)小鼠組、rsCD59a-FC預處理小鼠組在光凝后第3天、第5天未見CD59a mRNA表達下調。C57BL/6小鼠見少量膜攻擊復合物沉積、CD59a(-/-)小鼠見大量膜攻擊復合物沉積、rsCD59a-FC預處理組未見膜攻擊復合物沉積。光凝后第5天，C57BL/6小鼠見少量CNV生成；CD59a(-/-)小鼠見大量CNV形成；rsCD59a-FC預處理小鼠未見CNV形成。結論激光誘導小鼠CNV形成過程中，膜攻擊復合物起核心作用；CD59a調節(jié)補體激活,rsCD59a-FC通過阻斷MAC的沉積阻斷小鼠CNV的形成；rsCD59a-FC將成為治療AMD疾病的又一策略。[眼科新進展，2014，34(4)：330-332]

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是導致55歲以上患者失明的常見原因。雖然干性AMD更為普遍，但災難性的視覺喪失常與濕性AMD相關，尤其是并發(fā)癥脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)的發(fā)生[1-8]。用激光誘導小鼠CNV模型進行研究發(fā)現(xiàn)，補體的存在和激活是CNV發(fā)展的必要條件，補體激活與補體調節(jié)蛋白CD59緊密相關[9]。CD59通過阻斷膜攻擊復合物(membrane attack complex，MAC)的形成阻斷補體過度活化[10]，保護自體組織遠離損害。CD59在這個模型中的作用仍有待確定。小鼠CD59兩個亞基因分別為CD59a和CD59b。由于CD59a表達廣泛，而CD59b只在睪丸中表達[10]。因此本研究只探討CD59a在激光誘導小鼠CNV發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑聚焦顯微鏡LSM510(德國，Carl Zeiss)、Image-ProPlus圖像分析系統(tǒng)5.0(美國，Media Cybernetics);電泳儀(美國，Bio-Rad)。FITC-葡聚糖、抗羊CY3、mAb特定抗Elastin抗體(美國，Sigma-Aldrich);環(huán)噴托酯、復方托品酰胺、氯胺酮、甲苯噻嗪、羊抗鼠C3IgG片段和抗羊IgG抗體(美國，Sigma-Aldrich)。RT-PCR檢測試劑盒(美國，Applied Biosystems)，SV Total RNA 提取試劑盒(美國，Applied Biosystems)，rsCD59a-FC。

1.2實驗動物與分組雄性小鼠39只(4～6周齡;購自美國Jackson實驗室)，其中C57BL/6小鼠對照組21只；CD59a(-/-)小鼠組9只；rsCD59a-FC預處理小鼠組9只。1.3方法

1.3.1補體的溶血活性CH50檢測分別收集腹腔注射rsCD59a-FC(n=3)及腹腔注射PBS 24 h后(n=3)小鼠腹腔靜脈血,按試劑盒要求檢測CH50。

1.3.2CNV模型的建立各組小鼠左眼散瞳麻醉后，在視神經(jīng)周圍距視盤1.5～2.0 PD處，氪紅激光光凝視網(wǎng)膜(氪紅激光波長為659 nm,光斑直徑50 μm，曝光時間0.05 s，輸出功率為250 mW)，每眼等距離光凝5～8個點[3,5-6]。rsCD59a-FC預處理組激光光凝前24 h腹腔注射rsCD59a-FC每只小鼠50 μg[6]，余組不作處理。

1.3.3CNV觀察激光光凝后第5天，每組隨機選擇3只小鼠，麻醉后用1 mL含50 mg熒光標記FITC-Dextran PBS(pH=7.3)灌注心臟1 min 處死，摘下左眼，體積分數(shù)10%磷酸鹽緩沖福爾馬林固定，解剖顯微鏡下去除角膜、晶狀體、玻璃體，將RPE-脈絡膜-鞏膜復合體放射狀切開，用mAb抗elastin[3,5-6]染色彈力纖維及二抗Anti-goatCY3標記CNV。在共聚焦顯微鏡下觀察CNV的發(fā)生率。CNV復合物大小用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)進行分析。如綠色面積<3%激光斑面積表示無CNV形成，為陰性,否則為陽性[3,5-6]。

1.3.4MAC的免疫組織化學檢測每組隨機選擇3只小鼠于光凝后24 h處死，用多克隆抗體和Cy3結合的抗羊IgG 1200稀釋標記RPE-脈絡膜-鞏膜復合體的MAC，顯微鏡下觀察。

1.3.5RT-PCR檢測CD59amRNA表達C57BL/6 小鼠于光凝前及光凝后1 d、3 d、5 d、7 d (各時間點n=3)，麻醉處死后取左眼，SV Total RNA 試劑盒提取總RNA，0.2 μg RNA檢測CD59a mRNA水平。目的基因引物序列:β-actin (74 bp)上游引物：5’-GCC ACC AGT TCG CCA TGG ATG A-3’，下游引物：5’-GTC AGG CAG CTC ATA GCT CTT C-3’；CD59 (CD59a:204 bp、CD59b：237 bp)正向5’-GAT TCC TGT CTC-3’。

1.4統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行處理，組間比較采用t檢驗，兩組以上的數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1補體CH50檢測rsCD59a-FC預處理小鼠組與注射PBS的對照組相比，注射rsCD59a-FC小鼠24 h后CH50總溶血活性減少70%。

2.2激光誘導CNV復合物光凝后第5天，CD59a(-/-)小鼠出現(xiàn)大量新生血管CNV形成；C57BL/6小鼠出現(xiàn)少量新生血管CNV形成；rsCD59a-FC預處理小鼠未見CNV形成(圖1)。

Figure 1 CNV in each group at postoperative 5 days. A: A large number of CNV were formed in CD59a(-/-)mice (CNV complex was green, Bruch’s membrane and RPE was red); B: Few CNV were formed in C57BL/6 mice; C: No CNV was formed in rsCD59a-FC pretreatment mice 激光光凝第5天,各組小鼠CNV情況。A：CD59a(-/-)小鼠見大量CNV生成(CNV復合物顯綠色，Bruch膜及RPE顯紅色)；B：C57BL/6小鼠見少量 CNV生成；C：rsCD59a-FC預處理小鼠未見CNV生長

2.3新生血管復合物區(qū)域MAC的沉積光凝后24 h檢測RPE-脈絡膜-鞏膜復合體鋪片MAC，CD59a(-/-)小鼠見大量MAC強陽性染色；C57BL/6小鼠見少量MAC陽性染色；rsCD59a-FC預處理小鼠未見MAC陽性染色(圖2)。

2.4RT-PCR檢測CD59amRNA表達觀察C57BL/6小鼠光凝誘導后1 d、3 d、5 d、7 d CD59a mRNA表達，激光光凝后第3天、第5天CD59a mRNA表達下調(圖3)，分別為60%、30%。而CD59a(-/-)小鼠組、rsCD59a-F預處理小鼠組光凝后第3天、第5天未見CD59a mRNA表達下調。

3 討論

AMD是老年人致盲的主要眼病之一。臨床上將AMD分為干性和濕性兩大類，濕性AMD以CNV為主要特征。CNV穿過Bruch膜進入視網(wǎng)膜下,導致視網(wǎng)膜脫離，引發(fā)不可逆突發(fā)性中心視力喪失。濕性AMD是導致55歲以上的人視力不可逆喪失的主要原因[1-6]。

Figure 2 MAC at postoperative 24 hours in each group. A: A large number of MAC positive staining was observed in CD59a(-/-)mice; B: MAC positive staining in C57BL/6 mice; C: No staining for MAC in rsCD59a-FC pretreatment mice 光凝后24 h，各組小鼠MAC情況。A：CD59a(-/-)小鼠見大量MAC強陽性染色；B：C57BL/6小鼠對照組見MAC陽性染色(紅色)；C：rsCD59a-FC預處理小鼠組,未見MAC陽性染色

Figure 3 Expression of CD59a mRNA in C57BL/ 6 control group at pre-operation and postoperative 1 day, 3 day, 5 days and 7 days 光凝前及光凝誘導后第1天、第3天、第5天、第7天 C57BL/ 6小鼠對照組CD59a mRNA表達情況

正常情況下MAC會自發(fā)地少量沉積在組織，而在病理條件下補體MAC的大量沉積促使成纖維細胞生長因子和VEGF釋放增加[8]。研究表明MAC的形成通過替代途徑激活補體，MAC的沉積是激光誘導小鼠CNV發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)[6，10]。補體調節(jié)蛋白CD59[9]與補體激活緊密相關。Bora等[6]眼內補體CD59調節(jié)MAC形成，MAC大量沉積引起RPE-Brush膜-脈絡膜毛細血管變性，脈絡膜毛細血管進入RPE層下，導致CNV生成，引起AMD。但補體調節(jié)蛋白CD59在激光誘導CNV中的作用不明。

我們用激光光凝C57BL/ 6小鼠左眼誘導CNV形成，在激光光凝第3天、第5天，小鼠視網(wǎng)膜-脈絡膜-鞏膜CD59a mRNA表達下調，見MAC沉積，這些低表達的CD59a促進補體激活，導致MAC沉積增加，促進CNV生成，光凝后第5天見輕微CNV形成。有報道CD59通過阻斷MAC的形成，阻斷補體過度活化[9-10]，從而保護自體組織遠離損害。由于調節(jié)蛋白CD59a在體內控制補體激活和補體MAC的形成，故我們用CD59a基因缺失小鼠[9-10]，研究CD59a基因缺失時小鼠病程的嚴重程度。在這項研究中，我們發(fā)現(xiàn)：與C57BL/6小鼠對照組相比，CD59a缺失小鼠由于CD59a基因缺陷缺乏CD59a，從而導致補體過度活化形成更多的MAC[10]，造成大量MAC沉積在視網(wǎng)膜-脈絡膜-鞏膜，第5天形成大量CNV復合體，以及在稍后的時間形成更嚴重的CNV。

為了進一步分析CD59a在CNV的作用，我們在激光光凝小鼠左眼前注射rsCD59a-FC補體抑制劑，血清溶血活性CH50證實當小鼠注射rsCD59a-FC補體抑制劑后，補體活性降低70%(與對照組相比)。研究發(fā)現(xiàn)rsCD59a-FC預處理小鼠組，光凝后24 h小鼠視網(wǎng)膜-脈絡膜-鞏膜未見MAC沉積，光凝第5天亦未見CNV形成，由此推斷rsCD59a-FC抑制劑通過阻斷MAC形成從而阻斷CNV形成。進一步證實了我們先前的結果[7-8]。MAC是形成這種小鼠CNV模型的主要介質，由此我們提出抑制MAC形成可能是治療CNV的新策略或新方案。不久的將來，補體抑制劑將用于CNV的防治和治療，會成為治療AMD的新策略。

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6 Bora NS,Kaliappan S,Jha P,Xu Q,Sohn JH,Dhaulakhandi DB,etal.Complement activation via alternative pathway is critical in the development of laser-induced choroidal neovascularization:role of factor B and factor H[J].JImmunol,2006,177(3):1872-1878.

7 許琴，肖煜晨.激光誘導小鼠脈絡膜新生血管中補體C3的作用[J].眼科新進展,2011，31(8)：734-736.

8 許琴，黃亮，林素香，鄭水華，肖煜晨.激光誘導小鼠脈絡膜新生血管中膜攻擊物與血管生長因子的表達[J].眼科新進展,2013，33 (8)：729-732.

9 Holt DS,Botto M,Bygrave AE,Hanna SM,Walport MJ,Morgan BP.Targeted deletion of the CD59 gene causes spontaneous intravascular hemolysis and hemoglobinuria[J].Blood,2001,98(2):442-449.

10 Baalasubramanian S,Harris CL,Donev RM,Mizuno M,Omidvar N,Song WC,etal.CD59a is the primary regulator of membrane attack complex assembly in the mouse[J].JImmunol,2004,173(6):3684-3692.

date：Nov 26,2013

Science and Technology Support Project of Zhuhai City(No:2012D0401990022)From theDepartmentofClinicalLabotatory,theSecondPeople’sHospitolofZhuhai,Zhuhai519000,GuangdongProvince,China

Role of CD59a in laser-induced choroidal neovascularization

XU Qin,JIN Tao,LIN Su-Xiang,WANG Ya-Li,XIAO Yu-Chen

CD59a; choroidal neovascularization; macular degeneration

Objective To study the role of complement CD59a in laser-induced choroidal neovascularization (CNV). Methods Experiments in three groups: C57BL/6 mice control group, CD59a(-/-)mice group, rsCD59a-FC pretreatment mice group. CNV was induced by laser photocoagulation with the krypton red laser, the incidence of epithelium-choroid-sclera CNV were determined by confocal microscopy. RPE-choroid-scleral flat mounts were stained for membrane attack complex (MAC), and RT-PCR analysis was used to examine the expression of CD59a mRNA.Results The expressions of CD59a mRNA at postoperative 3 days, 5 days decreased 60% and 30% in C57BL/6 mice control group, which in CD59a(-/-)mice group and rsCD59a-FC pretreatment mice group unchanged. A few of MAC deposition was observed in CD59a (-/-)mice group, little was in C57BL/6 mice control group, and no MAC staining was observed in rsCD59a-FC pretreatment mice group. At postoperative 5 days, little CNV were induced in C57/BL6 mice group, many in CD59a(-/-)mice group, and no in CNV were induced in rsCD59a-FC pretreatment mice group.Conclusion MAC formation plays a central role in the laser-induced CNV, and CD59a plays a crucial role in regulating complement activation that driving the development of laser-induced CNV in mice. Administration of rsCD59a-Fc may provide a novel therapeutic alternative to current treatment.

許琴，女，1966年出生，江蘇人，碩士，副教授。研究方向：補體與年齡相關性黃斑病變。E-mail:1256294095@qq.com

AboutXUQin:Female,born in 1966.Associate professor.E-mail:1256294095@qq.com

2013-11-26

珠海市科技局基金(編號：2012D0401990022)

519000 廣東省珠海市，珠海市第二人民醫(yī)院

肖煜晨，E-mail:15190933845@qq.com

許琴,金濤,林素香,王雅麗,肖煜晨.CD59a在激光誘導小鼠脈絡膜新生血管形成中的作用[J].眼科新進展,2014,34(4):330-332.

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10.13389/j.cnki.rao.2014.0089

修回日期：2014-01-12

本文編輯：董建軍

Accepteddate:Jan 12,2014

Responsibleauthor:XIAO Yu-Chen,E-mail:15190933845@qq.com

[RecAdvOphthalmol，2014，34(4):330-332]