劉俊峰　郭雪峰

摘要：為了研究甘草皂苷對卡拉庫爾羊血液中免疫球蛋白IgA和IgG的影響，探討甘草皂苷的免疫學(xué)效應(yīng)。選取健康的卡拉庫爾羊6只，隨機(jī)分為2組，每組3只，平均體重為18.65 kg/只。飼養(yǎng)的第15、第30、第45天采集血液并分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測卡拉庫爾羊血清中免疫球蛋白IgA、IgG的水平。結(jié)果顯示：第15、第30、第45天的IgA試驗(yàn)組含量分別為84.75、93.16、86.31 μg/mL，對照組含量分別為43.13、42.57、32.63 μg/mL，且試驗(yàn)組顯著高于對照組（P<0.05）；IgG試驗(yàn)組的含量分別為87.99、83.00、76.29 μg/mL，對照組的含量分別為46.05、43.57、41.55 μg/mL，且試驗(yàn)組顯著高于對照組（P<0.05）。說明甘草皂苷可顯著提高卡拉庫爾羊血液中免疫球蛋白IgA、IgG的含量。

關(guān)鍵詞：甘草皂苷；卡拉庫爾羊；血液；IgA；IgG

中圖分類號： S858.262.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）01-0172-02

收稿日期：2013-05-31

基金項(xiàng)目：新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室課題（編號：HS201106）；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)博士基金（編號：2009JC08）。

作者簡介：劉俊峰（1980—），男，內(nèi)蒙古烏蘭察布人，碩士，講師，從事獸醫(yī)藥理與免疫藥理學(xué)研究。E-mail：liujunfeng423@163.com。

通信作者：郭雪峰，博士，副教授，從事反芻動物營養(yǎng)與飼料添加劑研究。E-mail：guoxuefeng807@163.com。甘草皂苷別稱甘草酸，是甘草的主要成分之一[1]，具有甜味（即甘草甜素），它屬于三萜類皂苷，為次生代謝產(chǎn)物。由于它的水溶液容易引起肥皂樣持久性泡沫，因此稱之為皂苷。隨著免疫學(xué)的迅速發(fā)展，對中草藥添加劑的免疫藥理研究也取得了較快的發(fā)展。國內(nèi)外許多科學(xué)家對中草藥添加劑在人、畜疾病上的免疫，尤其是與免疫有關(guān)的疾病防治進(jìn)行了大量的科學(xué)研究。例如，苜草素是一種苜蓿提取物，能增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能，相對減少了營養(yǎng)的沉積量[2]；黃芪皂苷能提高和促進(jìn)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能。另外，還有一些關(guān)于皂苷對人的免疫及其他應(yīng)用的研究，如高血脂病人應(yīng)用甘草甜素后，血漿免疫球蛋白IgG、IgA及補(bǔ)體C3含量均顯著降低，其作用主要為免疫增強(qiáng)、免疫調(diào)節(jié)和免疫抑制3種。皂苷成分類型多樣，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，性質(zhì)不穩(wěn)。

20世紀(jì)80年代，日本學(xué)者首次用試驗(yàn)證明，甘草甜素可抑制HIV增殖，并具有免疫激活作用[3]。張嫻文等發(fā)現(xiàn)三七皂苷具有抗肝纖維化作用[4]。甘草皂苷主要具有增強(qiáng)巨噬細(xì)胞和細(xì)胞免疫的功能，但對體液免疫功能有抑制作用。甘草提取物抑制抗體的作用已經(jīng)有不少報道，以羊的紅細(xì)胞作為抗原免疫動物，其注射后不久，受抑制反應(yīng)就會明顯，而抑制程度與甘草提取物的劑量有關(guān)；甘草皂苷也可以促進(jìn)羔羊生長，提高綿羊產(chǎn)毛量和產(chǎn)奶量；對綿羊疾病防治都有過研究，其效果也相對突出。本研究對卡拉庫爾羊飼喂添加甘草皂苷的日糧，采集卡拉庫爾羊血液并分離血清，測定免疫指標(biāo)，旨在確定甘草皂苷對卡拉庫爾羊血液IgA和IgG的影響，為開發(fā)以甘草皂苷為主要成分的飼料添加劑提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1甘草皂苷的檢驗(yàn)

1.1.1甘草的采集與前處理甘草于2012年3月在新疆阿克蘇阿拉爾市十二團(tuán)隨機(jī)采集，將采集回來的甘草切成1～2 cm 的小段，曬至半干，再放于50 ℃恒溫箱中烘干，再將樣品放入精密粉碎機(jī)（xf-96b）中進(jìn)行粉碎，重復(fù)2次，得到樣本，采用新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的提取方法提取甘草皂苷。

1.1.2皂苷的檢測

1.1.2.1泡沫試驗(yàn)取檢品的熱水溶液2 mL于帶塞試管中，用力振搖3 min，即產(chǎn)生持久性蜂窩狀泡沫（維持10 min以上），且泡沫量不少于液體體積的1/3。

1.1.2.2醋酐濃硫酸試驗(yàn)取樣品水溶液并置于平皿中，于水浴上蒸干，殘?jiān)尤肷倭勘姿崾蛊淙芙?，再加入醋酐濃硫酸?9 ∶1）試液，呈現(xiàn)紅紫色并變成綠色。

1.1.2.3比色法[5]準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于具塞試管中，水浴揮干溶劑，加入一定量的5%香草醛-冰醋酸溶液，再加入定量的高氯酸，搖勻，于水浴中加熱，立即取出用流水冷卻至室溫，加入冰醋酸稀釋，搖勻，以不加標(biāo)準(zhǔn)品的樣品管為空白，于400～700 nm波長處進(jìn)行掃描，香草醛高氯酸試劑在589 nm處有最大吸收峰，精密度高，加樣回收率99.23%。

1.2卡拉庫爾羊免疫球蛋白IgA、IgG的檢測

1.2.1試驗(yàn)動物的飼養(yǎng)管理選取健康的卡拉庫爾羊6只，隨機(jī)分為2組，每組3只，平均體重為18.65 kg/只。試驗(yàn)所用基礎(chǔ)日糧參照我國蘇尼特羊營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)[6-7]配制，精糧組成為：玉米68.53%，麩皮3.08%，胡麻餅20.09%，預(yù)混料804%，食鹽0.27%；營養(yǎng)水平為：消化能8.41 MJ/kg，粗蛋白11%，鈣4.96%，磷2.93%。精粗比為30 ∶70，精料 0.30 kg/（只·d），粗料為棉籽殼0.26 kg/（只·d）及青貯 0.44 kg/（只·d）。甘草皂苷在日糧中的添加量為 150 mg/kg，甘草皂苷由新疆阿拉爾新農(nóng)甘草產(chǎn)業(yè)有限責(zé)任公司按照試驗(yàn)要求提供，經(jīng)檢驗(yàn)符合試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2采血及血液處理靜脈采血5 mL，注入真空采血管，3 000 r/min離心10 min，取上清4 ℃冷藏待測。

1.2.3IgA、IgG檢測確定標(biāo)準(zhǔn)品中IgA的濃度梯度為160、80、40、20、10、5 μg/mL，IgG的濃度梯度則為64、32、16、8、4、2 μg/mL。由標(biāo)準(zhǔn)品稀釋5倍得到樣品稀釋液，用稀釋液濃度和D值共同繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)ELISA檢測試劑盒說明書，檢測卡拉庫爾羊血清樣品中IgA、IgG的含量。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0軟件中的平衡試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析過程（ANOVA），均值的多重比較采用Duncans法進(jìn)行，同時繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2結(jié)果與分析

2.1甘草皂苷提取結(jié)果檢測

由泡沫試驗(yàn)、醋酐濃硫酸試驗(yàn)、比色法證明試驗(yàn)所的甘草提取物為甘草皂苷。

2.2甘草皂苷對卡拉庫爾羊IgA含量的影響

2.2.1IgA含量的擬合方程根據(jù)試劑盒說明書，利用紫外分光光度計(jì)，在波長450 nm、光徑1 cm下，蒸餾水調(diào)零，測定標(biāo)品吸光度（x），擬合方程為y=0.051 1x+0.195 2（r2= 0.994 7），其中y為樣品IgA的含量，在0.05水平顯著，該方程符合試劑盒要求，可以以此為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算樣品中IgA含量。

2.2.2皂苷對IgA含量影響IgA為血清中的免疫球蛋白[7]，約占20%，結(jié)構(gòu)有多體形態(tài)，免疫功能分為血清型和分泌型，缺乏會導(dǎo)致體液免疫降低。有研究表明，馬的血液中IgA含量為27.5～120 μg/mL，綿羊的正常IgA含量范圍為 10～150 μg/mL，而人的正常范圍在0～3 900 μg/mL。本試驗(yàn)測得卡拉庫爾羊血液中IgA的含量在32～94 μg/mL范圍內(nèi)，與其他動物結(jié)果一致，說明本試驗(yàn)結(jié)果屬于正常范圍。由表1看出，在第15、第30、第45天測得試驗(yàn)組卡拉庫爾羊血液中IgA含量均顯著大于對照組（P<0.05）。說明甘草皂苷能顯著提高卡拉庫爾羊血液中免疫球蛋白IgA含量。 表1添加甘草皂苷對卡拉庫爾羊血清中IgA的影響

組別1各試驗(yàn)期血清中IgA含量（μg/mL）第15天1第30天1第45天1平均值對照組143.23±28.92a142.57±32.93a132.63±32.04a139.47±31.29a試驗(yàn)組184.75±21.10b193.16±22.47b186.31±9.31b188.07±17.63b注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同小寫字母者表示差異顯著（P<0.05）。下表同。

2.3甘草皂苷對卡拉庫爾羊IgG含量的影響

2.3.1IgG含量的擬合方程根據(jù)試劑盒說明書擬合本試驗(yàn)IgG回歸方程，放入紫外分光光度計(jì)，在波長450 nm、光徑1 cm下，蒸餾水調(diào)零，測定標(biāo)品吸光度（x），擬合方程為y=0019 9x+0.232 7（r2=0.992 8），其中y為樣品IgG的含量，在0.05水平顯著，該方程符合試劑盒要求，可以此為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算樣品中IgG含量。

2.3.2甘草皂苷對卡拉庫爾羊血清中IgG含量的影響IgG是血清中的免疫球蛋白，是血清的主要抗體成分，約占血清的50%，其半壽命期為10.6～14.5 d，在機(jī)體免疫中起保護(hù)作用，大多具有抗菌、抗病毒等感染性疾病的作用。有研究表明，兔子的血液中IgG含量為17.5～800.0 μg/mL；小鼠血液中的IgG含量為12.5～40.0 μg/mL。本試驗(yàn)測得卡拉庫爾羊血液中IgG含量在41～87 μg/mL之間，在報道的綿羊正常范圍（17～120 μg/mL）之內(nèi)。由表2可知，第15、第30、第45天所測得的試驗(yàn)組卡拉庫爾羊血清中IgG含量均大于對照組，且差異顯著（P<0.05）。說明本試驗(yàn)在飼料中添加甘草皂苷能使卡拉庫爾羊的血液中IgG含量明顯升高。表2添加甘草皂苷對卡拉庫爾羊血清中IgG含量的影響

組別1血清中IgG含量（μg/mL）第15天1第30天1第45天1平均值對照組146.05±13.18a143.57±6.68a141.55±9.28a143.72±9.71a試驗(yàn)組187.99±21.75b183.00±19.80b176.29±15.60b182.43±19.05b

3結(jié)論

甘草皂苷具有非特異性免疫調(diào)節(jié)作用，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，甘草皂苷能顯著提高小鼠對靜脈碳粒的廓清指數(shù)，說明其不僅具有增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的活性，同時具有非特異性免疫加強(qiáng)的作用，主要增強(qiáng)了細(xì)胞的免疫作用[8]，可選擇性地增強(qiáng)輔助性T細(xì)胞的增殖能力和活性，使CD4細(xì)胞增加、CD8細(xì)胞減少及胸腺外T淋巴細(xì)胞分化，對γ-干擾素產(chǎn)生誘發(fā)作用和NK細(xì)胞活化作用。但由于甘草皂苷同時具有類固醇作用，因而不能簡單地把它歸為免疫抑制劑，實(shí)際上它可能是具有雙向作用的免疫調(diào)節(jié)劑。本試驗(yàn)在飼料中添加甘草皂苷 150 mg/kg 飼喂卡拉庫爾羊，能提高血液中的IgA、IgG含量，說明甘草皂苷能提高卡拉庫爾羊的免疫水平。因此，可進(jìn)一步開展關(guān)于飼料添加劑應(yīng)用的研究，以提供更多的基礎(chǔ)試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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