紫外-可見分光光度法測定火龍果花中總黃酮的含量

羅小艷，郭璇華

（1.華南理工大學化學與化工學院，廣東廣州510640；2.廣東省綠色化學產(chǎn)品技術重點實驗室，廣東廣州510640）

紫外-可見分光光度法測定火龍果花中總黃酮的含量

羅小艷1，2，郭璇華1

（1.華南理工大學化學與化工學院，廣東廣州510640；2.廣東省綠色化學產(chǎn)品技術重點實驗室，廣東廣州510640）

研究火龍果花中黃酮類化合物的分離提取和測定方法。在單因素實驗的基礎上，利用正交實驗對分離提取條件進行優(yōu)化。結果表明，最佳分離提取條件為：乙醇濃度為70%，固液比為1∶40（g/mL），提取溫度為75℃，提取時間為2 h；以蘆丁為標準品，采用AlCl3顯色-分光光度法測得火龍果花中總黃酮含量為0.747%，樣品平均回收率為99.51%，RSD值為2.06%（n=5）。

火龍果花；總黃酮；紫外-可見分光光度法；AlCl3顯色法

火龍果（pitaya）又名紅龍果、仙蜜果，是蔓藤類仙人掌科（cactaceae）量天尺屬（又稱三角柱屬）（Hylocereusundatus）植物，原產(chǎn)于巴西、墨西哥等中美洲熱帶沙漠地區(qū)，在熱帶美洲、西印度群島及其它熱帶地區(qū)均有分布，為多年生攀緣性肉質熱帶作物[1-2]?；瘕埞ㄓ泄鉂嵕薮蟮幕ǘ?，花冠直徑25 cm，全長45 cm，單花重達600 g~800 g，被稱為“大花王”；它可以生食或作為煲湯原料，營養(yǎng)價值很高，具有降壓、解毒、潤肺、明目、養(yǎng)顏、延緩衰老等多種功效。

對火龍果全花和花不同部位的營養(yǎng)成分分析已有報道[3-4]，結果表明火龍果花營養(yǎng)豐富，富含糖、有機酸、膳食纖維、蛋白質和多種維生素及人體需要的鉀、鈣、鎂、磷等礦質元素；同時本課題組分析了火龍果花和莖中的化學成分[5-6]，對火龍果莖中總黃酮含量也進行了報道[7]。而王曉波等[8]對火龍果皮總黃酮對油脂抗氧化作用進行了研究；易衍等[9]對與火龍果花同種屬植物霸王花中的黃酮類成分進行了研究，從霸王花的乙醇提取物中分離并鑒定了13種黃酮醇及其苷類化合物，但是關于火龍果花中黃酮類化合物的提取檢測研究未見報道，因此分析火龍果花中總黃酮含量對火龍果花的綜合開發(fā)利用很有必要，以期為其生物活性評價及藥理作用提供參考。

黃酮類化合物是在植物中分布最廣的一類物質，幾乎每種植物體內(nèi)都有且存在于植物的所有部分——根、心材、邊材、樹皮、葉、果實和花中，在花、果實、葉中較多。目前國際上對黃酮類化合物的研究開發(fā)十分活躍，分離出來的黃酮類化合物有多種藥理作用，具有多種多樣的生理活性，如抗氧化、酶抑制劑、消除自由基，抗癌以及抑制腫瘤，改善心血管疾患，抗過敏及抗炎，抗微生物活性（抗真菌以及抗病毒活性）等作用[10]。所以了解火龍果花中的黃酮類化合物含量對于進一步開發(fā)利用其資源有很大的意義。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

火龍果花：市售袋裝干貨制品。用前將火龍果干花適當剪碎，在食物攪拌機上粉碎，過20目篩，置于干燥器中備用；蘆丁（C27H36O16·3H2O，分子量為664.57，BR）：國藥集團化學試劑有限公司；石油醚（沸程：30℃～60℃）、無水乙醇、NaNO2、NaOH、Al（NO3）3、AlCl3均為分析純。

蘆丁標準溶液（0.343 0mg/mL）：準確稱取在105℃干燥至恒重的蘆丁標準樣0.068 6 g，加適量無水乙醇溶解，稍加熱溶解，冷卻后移入200mL的容量瓶，用50%乙醇定容。

1.2 儀器

DG/20-002臺式干燥箱：重慶試驗設備廠；BS124S精密電子天平（感量0.1mg）：德國賽多利斯天平公司；RE-52CS型旋轉蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；U3010紫外可見分光光度計：日本HITACHI公司；索氏提取裝置。

式中：c為由回歸方程計算得到的待測液的濃度，（10-2mg/mL）；V1為提取液體積，mL；V2為稀釋后提取液體積，mL；V3為移取樣液的體積，mL；W為火龍果干花的重量，g。

2 方法

2.1 火龍果花樣品的預處理

將火龍果干花用濾紙包好，放入索氏提取器中用石油醚加熱提取6 h后置于通風處晾干溶劑。

2.2 火龍果花中總黃酮的提取

稱取1.50 g經(jīng)石油醚抽提后的火龍果花干品，置于100mL圓底燒瓶中，按不同的料液比加入一定濃度的乙醇溶液，在一定的溫度下加熱回流提取一定的時間，將提取液過濾后定容于100mL。

2.3 標準曲線的制作

準確移取0、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00、2.20mL蘆丁標準溶液于7個25mL容量瓶中，各加入3.00mL 1%AlCl3溶液，用10%的乙醇定容，顯色20min后在417nm處測定吸光度，同時以未加標準蘆丁的溶液作空白參比；以吸光度A為縱坐標，蘆丁濃度c（10-2mg/mL）為橫坐標作圖，回歸方程為：A=0.277 3c+0.0678 4，R=0.999 3。

2.4 樣品中總黃酮含量的測定

取4.00mL樣液于25mL容量瓶中，按照測定蘆丁標準液吸光度的步驟，同時做試劑空白，以試劑空白為對照，于417 nm處測定吸光度A；計算火龍果花中總黃酮的含量（%），重復5次，取平均值。按下列公式計算：

3 結果與分析

3.1 顯色方法的選擇

采用兩種顯色方法：在堿性條件下的NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法和在酸性條件下的AlCl3顯色法分別試驗。兩種方法顯色機理不同，前者顯色后溶液為橙紅色，而AlCl3顯色法得黃色溶液。在200 nm～600 nm的波長范圍內(nèi)進行掃描分別得圖譜1和2（見圖1、圖2）。

圖1 NaNO2-A l（NO3）3-NaOH顯色法的光譜圖Fig.1 Spectrogram of NaNO2-Al（NO3）3-NaOH coloration

圖2 AlCl3顯色法的光譜圖Fig.2 Spectrogram of A lCl3coloration

由圖2可見，蘆丁標準品經(jīng)AlCl3顯色后在417nm有較明顯的吸收峰，而NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法中蘆丁與Al3+配合物的峰在502.5 nm左右，但該處的吸收峰相對于AlCl3顯色法較弱?？紤]到火龍果花的黃酮提取液樣品中可能含有較多的雜質（如花青素、鞣酸及其它酚類成分），且在堿性條件下，有些非黃酮類物質會在502.5 nm附近有最大或較強吸收[11]，因而選用AlCl3顯色法測定火龍果花中黃酮類化合物具有更好的專屬性。

3.2 溶劑的選擇及樣品預處理

黃酮類物質水溶性較差，醇溶性較好，常用甲醇和乙醇作提取溶劑，但考慮到甲醇的毒性，而且乙醇不僅可以去除一部分親水性蛋白質，果膠及其他水溶性雜質，而且毒性小，價格低廉，可以回收利用，因此采用乙醇作為提取溶劑。但直接將火龍果干花用乙醇提取，會不可避免地將脂溶性色素一起提取出來，為了消除葉綠素等物質的影響，本文采用30℃～60℃沸程石油醚索氏提取6 h的方法進行簡單的提純，排除部分干擾物質。樣品經(jīng)石油醚脫脂、脫色脫蠟處理可提高總黃酮的提取率。這可能是由于蠟質的破壞及脂類的消除，有利于極性提取劑的滲透和黃酮類物質的滲出。

3.3 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選取影響火龍果花總黃酮提取效果各因素中有意義的水平做正交試驗，選擇乙醇的濃度（A）、料液比（B）、提取溫度（C）、提取時間（D）4個因素，采用四因素三水平L9（34）正交試驗表安排試驗，確定最佳提取工藝，因素水平見表1，試驗分析結果見表2，方差分析結果見表3。

表1 L9（34）正交試驗因素水平設計Table1 Factorsand levels for L9（34）orthogonalarray design

表2 正交試驗結果分析Table2 Resu ltsof orthogonalexperiments

表3 方差分析表Table3 Resultsof varianceanalysis

查表得F0.01(2，18)=6.01，F(xiàn)0.05(2，18)=3.55。因素A高度顯著，因素B、C顯著，因素D不顯著。由表2極差分析和表3方差分析結果可知，影響火龍果花中黃酮提取的各因素主次順序為：乙醇濃度＞料液比＞提取溫度＞提取時間。從平均值可見因素A和B的第3水平較好，C的第一水平較好，D因素的3個水平都差不多。從節(jié)約能源出發(fā)取提取時間較短的D1，于是選出來的最優(yōu)提取條件是A3B3C1D1。即火龍果花中總黃酮的最佳提取分離條件是：乙醇濃度為70%，固液比為1∶40（g/mL），提取溫度為75℃，提取時間為2 h。

3.4 火龍果花中總黃酮含量的測定

在最佳提取條件下，用AlCl3顯色法測得火龍果花中總黃酮含量為0.747%，結果如表4所示。

表4 樣品測定結果Table4 Determ ination resultsof sam ples

3.5 回收率實驗

稱取已知含量經(jīng)石油醚抽提后的火龍果花干品5份，每份1.5 g（準確至0.001 g），分別加入10.00mL蘆丁標準溶液，按照前述操作進行處理，測定吸光度，計算回收率，結果見表5。

表5 樣品加標回收率實驗結果Table5 Determ ination resultsof recovery in samples

由結果可知，該方法準確度良好。

4 小結

實驗結果表明：火龍果花中黃酮類化合物的最佳分離提取條件為：乙醇濃度為70%，固液比為1∶40（g/mL），提取溫度為75℃，提取時間為2 h。用AlCl3顯色法測得火龍果花中總黃酮的含量為0.747%，其含量是火龍果莖中總黃酮含量（0.494%）的1.5倍多，樣品平均回收率為99.51%，RSD值為2.06%。

[1]許偉東,廖劍鍬,劉加健,等.火龍果引種初報[J].中國南方果樹, 2002,31(1):33-34

[2]Nerd A,Sitrit Y,Kaushik R A,etal.High summer temperatures inhibit flowering in vine pitaya crops(Hylocereus spp.)[J].Scientia Horticulturae,2002(96):343-350

[3]羅小艷,郭璇華.火龍果花的營養(yǎng)成分分析[J].食品研究與開發(fā), 2008,29(1):147-149

[4]蔡永強,鄭偉,王彬.火龍果花營養(yǎng)成分分析[J].西南農(nóng)業(yè)學報, 2010,23(1):283-286

[5]郭璇華,羅小艷.GC-MS聯(lián)用分析火龍果花提取液的化學成分[J].分析試驗室,2008,27(12):84-87

[6]郭璇華,周麗屏.火龍果莖化學成分的GC-MS/ICP-MS分析[J].分析試驗室,2007,26(11):104-107

[7]郭璇華,戴文娟,梁博,等.分光光度法測定火龍果莖中黃酮類化合物的含量[J].中國食品添加劑,2010(2):210-213

[8]王曉波,鐘嬋君,劉冬英,等.火龍果皮總黃酮對油脂抗氧化作用的研究[J].食品研究與開發(fā),2012,33(3):19-23

[9]易衍,巫鑫,王英,等.霸王花黃酮類成分研究[J]中草藥,2011,34(5): 712-716

[10]唐傳核.植物生物活性物質[M].北京:化學工業(yè)出版社,2005:34-35

[11]郭亞健,范莉,王曉強,等.關于NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法測定總黃酮方法的探討[J].藥物分析雜志,2002,22(2):97-99

Determ ination of Total Flavonoids in Pitaya Flower by UV-Vis Spectrophotom etry

LUOXiao-yan1，2，GUOXuan-hua1

（1.School of Chemistry and Chemical Engineering，South China University of Technology，Guangzhou 510640，Guangdong，China；2.The Guangdong Provincial Key Lab of Green Chemical Product Technology，Guangzhou 510640，Guangdong，China）

In thispaper，theextractionand separationof the total flavones from pitaya flowerwerestudied.Based on single-factorexperiment，the extraction processconditionswereoptimized by using orthogonal test.Results showed thattheoptimalextraction conditionswereas follows：ethanolconcentration70%，ratioof rawmaterial to ethanolsolution1∶40（g/mL），extraction temperature75℃and extraction time2 h.Under theabove conditions，the contentof total flavones from dry pitaya flowerwas0.747%.Theaverage recovery rateand RSDwere99.51% and 2.06%respectively（n=5）.

pitaya flower；total flavonoids；UV-Visspectrophotometry；AlCl3coloration

2013-05-20

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.23.029

羅小艷（1982—），女（漢），助理實驗師，碩士，研究方向：食品與天然物分析。