高效液相色譜法測(cè)定潮州花生糖中的黃曲霉毒素B1

謝鴻，楊澤川，陳旭明

（廣東省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站（潮州），廣東潮州521011）

高效液相色譜法測(cè)定潮州花生糖中的黃曲霉毒素B1

謝鴻，楊澤川，陳旭明

（廣東省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站（潮州），廣東潮州521011）

建立免疫親和層析凈化-高效液相色譜法測(cè)定潮州花生糖中的黃曲霉毒素B1的檢測(cè)方法。樣品用甲醇-水（7+ 3）提取，定性濾紙和玻璃纖維濾紙2次過(guò)濾，過(guò)免疫親和柱凈化；洗脫液氮?dú)獯蹈珊蠹诱和楹腿宜嵫苌?，以?乙腈（85+15）溶解，用高效液相色譜儀帶熒光檢測(cè)器檢測(cè)。方法在0.002 5ng/μL~0.100 ng/μL的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，加標(biāo)平均回收率為85.3%~92.9%，試驗(yàn)的RSD為0.61%~1.08%。該方法通過(guò)改進(jìn)柱前衍生化的條件和優(yōu)化儀器分析條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性好，回收率高，結(jié)果準(zhǔn)確，為黃曲霉毒素B1的檢測(cè)提供了準(zhǔn)確可靠的方法。

免疫親和層析凈化；高效液相色譜法；黃曲霉毒素B1

在潮州方言里，潮州花生糖又叫豆方，是潮州正宗傳統(tǒng)特色小吃——配茶甜點(diǎn)。潮州人吃豆方有2個(gè)最傳統(tǒng)的日子，一個(gè)是中秋節(jié)前后，豆方是中秋祭拜月亮娘娘必備的祭品之一；另一個(gè)是結(jié)婚的時(shí)候，供客人享用并作為禮物帶走。潮汕地區(qū)有一個(gè)習(xí)俗，誰(shuí)家娶媳婦的時(shí)候，都要分送鄰居豆方，潮州話稱為“食知”、“食甜”，也就是讓鄰居們知道自家的喜事。豆方制作的主要原料是花生，糖，麥芽糖。

霉菌毒素（mycotoxins），又稱真菌毒素，是某些霉菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中產(chǎn)生的二次代謝有毒產(chǎn)物[1]。在所有霉菌毒素中，黃曲霉毒素的毒性、致癌性、污染頻率均居首位，是已知毒性最強(qiáng)的天然物質(zhì)[2]，1993年被WHO癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為Ⅰ類致癌物[3]。在天然污染的食品中存在的黃曲霉毒素以B1污染最多見(jiàn)，黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1簡(jiǎn)寫為AFB1）是一類結(jié)構(gòu)相似且具有較強(qiáng)毒性和致癌性的呋喃類化合物[4]，是目前已知的化學(xué)物質(zhì)中致癌性最強(qiáng)的一種。黃曲霉毒素B1對(duì)包括人和若干動(dòng)物具有強(qiáng)烈的毒性，其毒性作用主要是對(duì)肝臟的損害。黃曲霉毒素存在于土壤，動(dòng)植物，各種堅(jiān)果，特別是花生和核桃中，在曬干、儲(chǔ)存、加工原料花生的過(guò)程中，都會(huì)引入黃曲霉毒素[5]，黃曲霉毒素不僅毒性大、分布廣，而且結(jié)構(gòu)也比較穩(wěn)定，一般在食物的熱加工過(guò)程中都不易被破壞，因此給消費(fèi)者的飲食安全埋下了巨大的隱患[2]。

黃曲霉毒素污染一直是食品及飼料行業(yè)極為關(guān)注的課題。近年來(lái)，隨著我國(guó)人民生活水平的提高，政府和人民群眾對(duì)食品質(zhì)量的要求越來(lái)越高[6]。然而，要消除霉菌毒素造成的困擾卻不容易，其中一個(gè)非常重要的原因是這些毒素的濃度通常很低，難以用常規(guī)方法測(cè)出[1]，目前該類物質(zhì)的檢測(cè)方法主要包括免疫分析法，薄層色譜法和高效液相色譜法，利用高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)黃曲霉毒素，是分析測(cè)試的一個(gè)主要方法。實(shí)驗(yàn)材料選用地方特色食品潮州豆方為代表，因其制作過(guò)程大量使用花生為原料，黃曲霉毒素殘留的可能性較大，研究采用黃曲霉毒素免疫親和柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化，利用高效液相色譜儀進(jìn)行定量分析。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、材料及耗材

1.1.1 儀器

安捷倫1260型HPLC帶熒光檢測(cè)器：檢測(cè)器型號(hào)：G1321B；EL-320S電子天平：常州天之平儀器設(shè)備有限公司；XW-80A旋渦混合器：上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠；固相萃取裝置：艾貝爾科技有限公司；AP-01P真空泵：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；HGC-12A氮吹儀；DHG-9245A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司。

1.1.2 材料及耗材

市售花生糖；黃曲霉毒素B1免疫親和柱（Pribo－Fast IAC-010-3mL）；乙酸銨（分析純）、甲醇（色譜純）；乙腈（色譜純）、正己烷（分析純）、三氟乙酸、黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)液（Analytical Laboratory濃度：25μg/mL）。

1.2 溶液配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

將黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)液（濃度：25μg/mL）1mL轉(zhuǎn)移到10mL容量瓶，用乙腈定容至刻度，配制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，此溶液濃度為2.5μg/mL，于4℃冰箱中保存，乙腈為色譜級(jí)試劑。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液

根據(jù)需要，將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，標(biāo)準(zhǔn)工作液在使用前配制。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18 Analytical（150mm×4.6mm，5μm）；進(jìn)樣量：5μL；流速為1mL/min；柱溫為45℃；流動(dòng)相為A-水∶B-乙腈∶C-甲醇∶D-20mmol/L乙酸銨（37∶19∶14∶30），等度洗脫；熒光檢測(cè)器波長(zhǎng)：Ex=360、Em=440。

1.4 樣品處理。

1.4.1 提取

稱取均勻的樣品（6.00±0.05）g到50mL具塞比色管中，加30mL甲醇-水（7+3），渦旋混勻30min，定容至50mL，定性濾紙過(guò)濾，取5mL濾液，加水稀釋，用玻璃纖維濾紙過(guò)濾，收集濾液待過(guò)黃曲霉毒素免疫親和柱。

1.4.2 凈化

黃曲霉毒素B1免疫親和柱，于使用前提前30min從4度冰箱中取出，上樣前讓柱子里的保護(hù)液全部流凈。取1.4.1收集的濾液全部過(guò)柱，用5mL水淋洗，抽干柱子，最后用1mL乙腈洗脫，整個(gè)過(guò)程流速控制不超過(guò)1mL/min，盡可能低流速，有利于目標(biāo)物的吸附。

1.4.3 柱前衍生化

取洗脫液200μL，60℃下氮?dú)獯蹈?，加?00μL正己烷和100μL三氟乙酸，密閉混勻30 s后，在（45± 1）℃烘箱中衍生25min后，于室溫下氮?dú)獯蹈桑?00μL水-乙腈（85+15）溶解，混勻30 s，供高效液相色譜儀測(cè)定。

2 定性與定量

采用檢測(cè)器對(duì)化合物的色譜峰的保留時(shí)間定性、確證，并用外標(biāo)峰面積法定量。黃曲霉毒素B1檢測(cè)結(jié)果計(jì)算公式為：

式中：X為樣品中黃曲霉毒素B1含量，（μg/kg）；c為標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)后試液中黃曲霉毒素B1的濃度，（ng/μL）；v為試液定容體積，mL；m為試樣質(zhì)量，g；f為濃縮倍數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 校正曲線

按選定的儀器條件對(duì)已配制的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行測(cè)量，以組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，組分的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制校正曲線，校正曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)如表1所示，校準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

表1 校正曲線及相關(guān)系數(shù)Table1 Standard curveand correlation coefficient

圖1 黃曲霉毒素B1校正曲線Fig.1 Standard curveof aflatoxin B1

3.2 分析方法的準(zhǔn)確度（回收率試驗(yàn)）及精密度

以花生糖為實(shí)驗(yàn)樣品（新鮮花生糖和已發(fā)霉花生糖），每個(gè)樣品分別稱取約6.00 g各3份，于新鮮花生糖中加入不同體積的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1.0、1.5 ng/μL 3個(gè)濃度，按1.4的步驟進(jìn)行樣品處理，處理成3個(gè)不同的加標(biāo)濃度，分別為0.05、0.1、0.15 ng/μL；于發(fā)霉花生糖中加入不同體積的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.5、0.8 ng/μL 3個(gè)濃度，同樣按1.4的步驟進(jìn)行樣品處理，處理成3個(gè)不同的加標(biāo)濃度，分別為0.008、0.01、0.05 ng/μL；每個(gè)質(zhì)量濃度測(cè)6次，測(cè)試的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品加標(biāo)回收的色譜圖分別見(jiàn)圖2至圖6。

4 討論

從20世紀(jì)60年代初發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素以來(lái)，檢測(cè)黃曲霉毒素B1的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）、酶聯(lián)免疫法（ELISA）、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC/MS）等。黃曲霉毒素免疫親和柱HPLC法采用單克隆抗體免疫技術(shù)，可以特效地將黃曲霉毒素與其他真菌素分離出來(lái)，分離效率和回收率高。此方法已得到廣泛應(yīng)用，并被美國(guó)官方分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（AOAC）確認(rèn)為官方檢測(cè)方法。

表2 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果及精密度結(jié)果（n=6）Table2 Recoveriesand precision of them easured results（n=6）

圖2 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液0.012 5 ng/μL色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram ofaflatoxin B1standards（0.012 5 ng/μL）

圖3 新鮮花生糖空白樣品色譜圖Fig.3 HPLC chrom atogram of fresh peanutbrittle

圖4 空白樣品加標(biāo)色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram ofblank samp leadd standard solution 0.1 ng/μL

圖5 發(fā)霉花生本底色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of thebackground ofmoldy peanutbrittle

圖6 本底濃度加標(biāo)0.05 ng/μL色譜圖Fig.6 HPLC chrom atogram of thebackground ofmoldy peanut brittleadd standard solution 0.05 ng/μL

檢測(cè)前樣品使用免疫親和柱進(jìn)行層析凈化，該柱采用高特異性和高親和力的的單克隆抗體，采用3mL柱管，柱容量高，可以有效的提高純化效率，符合國(guó)內(nèi)外霉菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明具有良好的穩(wěn)定性和可靠性，回收率可達(dá)90%。親和柱使用前應(yīng)恢復(fù)到室溫，可以提高柱子的活性。樣品在提取時(shí)用的是甲醇-水（7+3），上柱子的樣品溶液取5mL，加水稀釋是降低樣品溶液中有機(jī)溶劑的含量（大概低至10%或以下），原因是因?yàn)橛袡C(jī)溶劑溶度太高會(huì)破壞柱子中的單克隆抗體，降低對(duì)黃曲霉毒B1的特異性吸附，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；基于這種原因，在最后洗脫時(shí)，加1mL乙腈洗脫則要分2次加入，加入后讓其浸泡柱子中的吸附劑，充分溫育2min~5min，再低流速洗脫，原因是破壞抗體，使其與黃曲霉毒素B1分離，達(dá)到徹底的洗脫目標(biāo)物。

采用高效液相色譜法檢測(cè)黃曲霉毒素B1，可以使用正相和反相液相色譜法進(jìn)行，而反相因?yàn)椴僮鞅容^容易，流動(dòng)相毒性相對(duì)較低，因而被廣泛采用。樣品提取和凈化后，可以通過(guò)柱前衍生法和柱后衍生法，提高黃曲霉毒素B1檢測(cè)的靈敏度。柱前衍生法無(wú)需專用的柱后衍生反應(yīng)系統(tǒng)，方法簡(jiǎn)單，本實(shí)驗(yàn)采用柱前衍生法，通過(guò)加入三氟乙酸進(jìn)行衍生，通過(guò)適當(dāng)提高衍生的溫度和時(shí)間，可以更好的增強(qiáng)黃曲霉毒素B1的熒光強(qiáng)度，提高檢測(cè)靈敏度。日本CSC相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，經(jīng)過(guò)三氟乙酸衍生的黃曲霉毒素B1比未經(jīng)過(guò)衍生的保留時(shí)間提前一半，峰面積增加近20倍，峰高則增加近30倍，可見(jiàn)經(jīng)過(guò)衍生可以顯著增強(qiáng)檢測(cè)靈敏度。

研究用免疫親和柱層析凈化-高效液相色譜法檢測(cè)黃曲霉毒素，因?yàn)槊嘎?lián)免疫吸附法僅能檢測(cè)單一毒素（如黃曲霉毒素B1）含量，而且易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，難以控制；TLC法樣品前處理繁瑣，且提取和凈化效果不夠理想，提取液中雜質(zhì)較多，在展開(kāi)時(shí)影響斑點(diǎn)的熒光強(qiáng)度；免疫親和柱的使用可以避免傳統(tǒng)TLC和HPLC的缺點(diǎn)，它采用單克隆抗體免疫技術(shù)，可以特效性地將黃曲霉毒素或其他真菌毒素分離出來(lái)，分離效率和回收率高?？朔薚LC和HPLC法在操作過(guò)程中使用劇毒的真菌毒素作為標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)物和在樣品預(yù)處理過(guò)程中使用多種有毒，異味的有機(jī)溶劑，毒害操作人員和污染環(huán)境的缺點(diǎn)，因而免疫親和柱-高效液相色譜法比傳統(tǒng)的HPLC法更加安全，可靠，兩者結(jié)合可以大大提高工作效率，提高靈敏度和準(zhǔn)確度，應(yīng)用于質(zhì)量檢測(cè)部門對(duì)黃曲霉毒素B1的檢測(cè)，效果滿意。

[1]朱聰英,應(yīng)永飛,韋敏玨,等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定飼料中黃曲霉毒素的研究[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào),2010,31(4):240-246

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[3]楊琳,張宇昊,馬良.高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)糧谷中的黃曲霉毒素和赭曲霉毒素[J].食品科學(xué),2010,31(24):250-254

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Determ ination of Aflatoxin B1in Chaozhou Peanut Brittle by High Performance Liquid Chromatography

XIEHong，YANG Ze-chuan，CHEN Xu-ming

（Food Quantity Supervision and Inspection station of Guangdong（Chaozhou），Chaozhou 521011，Guangdong，China）

A method was developed for the determination of Aflatoxin B1 in Chaozhou peanut brittle by Immunoaffinity chromatography and High Performance Liquid Chromatography.Samplesextracted withmethanol -water（7+3），filtered with qualitative filter paper and glass fiber filter paper，purified by immunoaffinity column；Eluatewasdriedwith nitrogen，and derived byn-hexaneand trifluoroaceticacid，dissolvedwithwateracetonitrile（85+15）and detected by high performance liquid chromatographywith fluorescence detection.The calibration curvesare linearbetween 0.002 5 ng/μLand 0.100 ng/μL.The rateofaverage recovery ofaflatoxin B1was85.3%-92.9%，and RSDs ranged from 0.61%to1.08%.In thispaper，optimized the condition ofHPLCand theconditionsofpre-column derivatization，themethod has theadvantagesofsimplicity，rapidity，precision，good reproducibilityand high recovery，so thatitcould beused for thedetermination ofaflatoxin B1，and itcanmeetthe need ofmeasuring in food safety control.

immunoaffinity chromatography；HPLC；aflatoxin B1

2013-08-07

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.23.024

謝鴻（1981—），男（漢），工程師，本科，主要從事食品檢測(cè)-儀器分析方面的工作。