保加利亞乳桿菌微囊化活菌制劑的研究

關(guān)海濱，董至恒，包小妹，石瑞文，喬俊纏

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010110）

保加利亞乳桿菌微囊化活菌制劑的研究

關(guān)海濱，董至恒，包小妹，石瑞文，喬俊纏*

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010110）

制備保加利亞乳桿菌的微囊化制劑。液體發(fā)酵法制備保加利亞乳桿菌，以海藻酸鈉為囊材制備保加利亞乳桿菌微囊。微囊化保加利亞乳桿菌的凍干存活率為45.07%，與傳統(tǒng)方法（凍干存活率為44.35%）相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。人體胃液和腸液耐受性試驗(yàn)結(jié)果顯示，在人體胃液中微囊化的菌體3 h后菌體存活率達(dá)到71.16%，而對(duì)照的存活率僅為16.47%；在人體腸液中微囊化的菌體6h后菌體存活率達(dá)到71.67%，而對(duì)照的存活率僅為30.46%。微囊起到了保護(hù)保加利亞乳桿菌免受人體胃液和腸液破壞的作用。

保加利亞乳桿菌；微囊；海藻酸鈉；存活率

微生態(tài)制劑因其具有“患病治病，未病防病，無病保健”的效果。已經(jīng)廣泛應(yīng)用于保健食品和藥品中[1]。微生態(tài)制劑，是通過加入對(duì)人體有益的微生物，從而調(diào)整胃腸道微生態(tài)的平衡，控制菌群失調(diào)、促進(jìn)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、提高人體的健康水平[2]。保加利亞乳桿菌（Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus）對(duì)人體的健康起到非常重要的作用，保加利亞乳桿菌屬于德氏乳桿菌屬，保加利亞亞種，保加利亞乳桿菌繁衍至今已經(jīng)遍布全世界[3]。由于保加利亞乳桿菌具有促進(jìn)胃腸道消化吸收、增加免疫、抗癌等重要的生理功能，因此被規(guī)定為可用于保健食品和藥品的益生菌菌種之一，在醫(yī)藥、乳品、飼料添加劑、保健品等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[4-6]。目前一些大品牌的酸奶、奶油、干酪以及臨床上應(yīng)用的微生態(tài)制劑培菲康、金雙歧都含有保加利亞乳桿菌，隨著生物技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，保加利亞乳桿菌的性能將會(huì)被進(jìn)一步開發(fā)[7-8]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌源

保加利亞乳桿菌（Lactobacillusdelbrueckiisubsp. bulgaricus）：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 試劑和儀器

MRS液體培養(yǎng)基：葡萄糖1.0%、蛋白胨1.0%、酵母膏1.0%、牛肉粉0.5%、乙酸鈉0.5%、檸檬酸三銨0.5%、吐溫-80 0.1%、MgCl20.05%、MnCl20.02%、K2HPO40.05%，用5.0%的NaOH調(diào)節(jié)pH為7.0~7.2。MRS固體培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基加入1.5%的瓊脂，121℃滅菌30min，至4℃冰箱保存。凍干保護(hù)劑：乳糖50%、脫脂奶粉25%，115℃滅菌20min，至4℃冰箱保存。模擬人體胃液：NaCl0.3%、KCl0.2%、胃蛋白酶0.5%，用HCl調(diào)節(jié)pH為2.0，0.22μm微孔濾膜過濾滅菌。模擬人體腸液：KH2PO40.5%、胰蛋白酶0.3%，用NaOH調(diào)節(jié)pH為8.0，0.22μm微孔濾膜過濾滅菌。Thermo Scientific 1029厭氧培養(yǎng)箱：美國(guó)Thermo公司；CX21-BIM顯微鏡：日本OLYMPUS公司；FD-2.5E凍干機(jī)：美國(guó)SIM公司。

1.2 方法

1.2.1 保加利亞乳桿菌的培養(yǎng)及發(fā)酵液活菌數(shù)的測(cè)定

菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)采取三級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)，具體操作過程為：將一支凍干菌種接入裝量為60mLMRS液體培養(yǎng)基的100mL三角瓶中，37℃厭氧培養(yǎng)12 h后取出，作為一級(jí)種子；一級(jí)種子按5%的接種量接入裝量為150mLMRS液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，37℃厭氧培養(yǎng)12 h后取出，作為二級(jí)種子；二級(jí)種子按5%的接種量分別接入6個(gè)裝量為400mLMRS液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，37℃厭氧培養(yǎng)12 h后取出，得到三級(jí)發(fā)酵液，平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)發(fā)酵液活菌數(shù)，方法參照GB/T4789.2-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》。

1.2.2 微囊的制備及凍干微囊與凍干菌粉存活率的比較

取1 L發(fā)酵液8 000 r/min離心30min，棄去上清液，將離心得到的菌泥與30mL凍干保護(hù)劑混合，加入到60 mL海藻酸鈉（3.0%）溶液中，混勻，滴入若干1.1%的CaCl2，固化30min，過濾收集微囊，冷凍干燥，得到保加利亞乳桿菌微囊27.4 g。稱取凍干微囊1.0 g，加入到10mL 0.12mol/LNa2HPO4和0.04mol/L檸檬酸的緩沖液（pH 7.2）中，劇烈震蕩15min使微囊充分溶解，梯度稀釋，平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)活菌數(shù)。保加利亞乳桿菌的凍干微囊存活率等于凍干微囊的總活菌數(shù)比發(fā)酵液總活菌數(shù)。

取1 L發(fā)酵液8 000 r/min離心30min，棄去上清液，將離心得到的菌泥與30mL凍干保護(hù)劑混合，冷凍干燥，得到保加利亞乳桿菌乳桿菌菌粉21.8 g。稱取凍干菌粉1.0 g，加入到10mL 0.12mol/LNa2HPO4和0.04mol/L檸檬酸的緩沖液（pH 7.2）中，劇烈震蕩15min使菌粉充分溶解，梯度稀釋，平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)活菌數(shù)。保加利亞乳桿菌的凍干菌粉存活率等于凍干菌粉的總活菌數(shù)比發(fā)酵液總活菌數(shù)。

1.2.3 保加利亞乳桿菌微囊在模擬人體胃液中的存活試驗(yàn)

取5 g保加利亞乳桿菌微囊加入到50mL模擬人體胃液中，37℃水浴，分別在0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h取樣。以相同活菌總數(shù)的保加利亞乳桿菌凍干菌粉4.04 g為對(duì)照，平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)人體胃液中活菌數(shù)的變化。

1.2.4 保加利亞乳桿菌微囊在模擬人體腸液中的存活試驗(yàn)

取5 g保加利亞乳桿菌微囊加入到50mL模擬人體腸液中，37℃水浴，分別在0、1、2、3、4、5、6h取樣。以相同活菌總數(shù)的保加利亞乳桿菌凍干菌粉4.04 g為對(duì)照，平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)人體腸液中活菌數(shù)的變化。

2 結(jié)果

2.1 保加利亞乳桿菌發(fā)酵液活菌數(shù)的測(cè)定

經(jīng)測(cè)定，保加利亞乳桿菌發(fā)酵液活菌數(shù)為（15.73± 0.91）×108CFU/mL（n=4）。

2.2 凍干微囊與凍干菌粉存活率的比較

經(jīng)測(cè)定，保加利亞乳桿菌凍干微囊活菌數(shù)為（258.75±7.93）×108CFU/g（n=4）。凍干微囊存活率=（258.75×108CFU/g×27.4 g）/（15.73×108CFU/mL× 1 000mL）=45.07%。經(jīng)測(cè)定，保加利亞乳桿菌凍干菌粉活菌數(shù)為（320.00±8.29）×108CFU/g（n=4）。凍干菌粉存活率=（320.00×108CFU/g×21.8 g）/（15.73× 108CFU/mL×1 000mL）=44.35%。

保加利亞乳桿菌凍干微囊的存活率為45.07%，使用傳統(tǒng)方法制備的保加利亞乳桿菌凍干菌粉的存活率為44.35%，兩者比較并未有明顯差別，可見，微囊對(duì)凍干存活率的影響較小。

2.3 保加利亞乳桿菌微囊在模擬人體胃液中存活試驗(yàn)

由表1、2可知，在模擬人體胃液中，微囊化的保加利亞乳桿菌活菌數(shù)緩慢下降，3 h后活菌數(shù)由（254.00±5.60）×108CFU/g（n=4）降低至（180.75±3.59）× 108CFU/g（n=4），存活率達(dá)到71.16%。而直接加入保加利亞乳桿菌菌粉，其活菌數(shù)快速下降，3 h后活菌數(shù)由（258.00±7.39）×107CFU/g（n=4）降低至（42.50±4.80）× 107CFU/g（n=4），存活率為16.47%。

2.4 保加利亞乳桿菌微囊在模擬人體腸液中存活試驗(yàn)

由表3、4可知，在模擬人體腸液中，微囊化的保加利亞乳桿菌活菌數(shù)緩慢下降，6 h后活菌數(shù)由（255.00± 7.07）×107CFU/g（n=4）降低至（182.75±4.34）×107CFU/g（n=4），存活率達(dá)到71.67%。而直接加入保加利亞乳桿菌菌粉，其活菌數(shù)快速下降，6 h后活菌數(shù)由（255.25±9.54）×107CFU/g（n=4）降低至（77.75±8.62）×107CFU/g（n=4），存活率為30.46%。

表1 保加利亞乳桿菌微囊對(duì)模擬人體胃液的耐受性Table1 Toleranceof Lactobacillusbulgaricus m icrocapsule to artificialgastric juice

表2 保加利亞乳桿菌菌粉對(duì)模擬人體胃液的耐受性Table2 Toleranceof Lactobacillusbulgaricus powder to artificialgastric juice

表3 保加利亞乳桿菌微囊對(duì)模擬人體腸液的耐受性Table3 Toleranceof Lactobacillusbu lgaricus m icrocapsule to artificial intestinal juice

表4 保加利亞乳桿菌菌粉對(duì)模擬人體腸液的耐受性Table4 Toleranceof Lactobacillusbulgaricus powder to artificial intestinal juice

3 討論

微囊是利用天然或合成的高分子材料作為囊殼，將固態(tài)或液態(tài)藥物包裹成為微型膠囊，微囊可以掩蓋食品、藥物的不良?xì)馕?，還能提高其穩(wěn)定性，減少食品、藥物對(duì)胃腸的刺激[9，11]。本實(shí)驗(yàn)使用海藻酸鈉作為囊殼材料，將保加利亞乳桿菌包裹在微囊內(nèi)。通過冷凍干燥得到保加利亞乳桿菌微囊，微囊的凍干存活率達(dá)到45.07%，而使用傳統(tǒng)方法制得的保加利亞乳桿菌菌粉凍干存活率為44.35%，兩者的凍干存活率沒有明顯差別，可見微囊化對(duì)保加利亞乳桿菌的凍干存活率沒有影響。

含益生菌類的食品、藥品的活性關(guān)鍵在于菌體是否存活，在人體內(nèi)，結(jié)腸的環(huán)境適合細(xì)菌生存，是腸道細(xì)菌的主要棲息地，但口服含益生菌類的食品、藥品必須經(jīng)過胃和小腸，胃液的強(qiáng)酸性和所含的胃蛋白酶能殺死大多數(shù)細(xì)菌，腸當(dāng)中的胰蛋白酶也會(huì)殺死大量細(xì)菌[12-14]。本實(shí)驗(yàn)中，以微囊包裹保加利亞乳桿菌，通過模擬人體胃液和腸液實(shí)驗(yàn)，保加利亞乳桿菌微囊可以很好的抵御酸、堿環(huán)境以及胃蛋白酶和胰蛋白酶。在模擬人體胃液中，大多數(shù)益生菌難以耐受pH 2.0的酸性環(huán)境和胃蛋白酶的作用，在作用3 h后保加利亞乳桿菌微囊存活率為71.16%，對(duì)照保加利亞乳桿菌菌粉的存活率為16.47%，微囊使保加利亞乳桿菌在胃液中的存活率明顯提高。在模擬人體腸液中，pH 8.0的堿性環(huán)境和胰蛋白酶的作用也會(huì)造成菌體的大量死亡，在作用6 h后保加利亞乳桿菌微囊存活率為71.67%，對(duì)照保加利亞乳桿菌菌粉的存活率為30.46%，微囊使保加利亞乳桿菌在腸液中的存活率明顯提高。

市售含益生菌類的食品、藥品大多是片劑、膠囊和散劑，菌體經(jīng)過胃腸時(shí)很難受到保護(hù)，能存活下來的菌體很少，而微囊能提高菌體的存活率。因此，益生菌微囊的開發(fā)和利用對(duì)食品、藥品、飼料添加劑和保健品新產(chǎn)品的研發(fā)有廣闊的前景。

[1]王婷婷,李愛科,陶浩瀚,等．微囊化屎腸球菌活菌制劑的研究[J]．西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào),2009,37(12):59-70

[2]李寧．雙歧桿菌微膠囊制備工藝及功能特性的研究[D]．保定:河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2007

[3]鄒強(qiáng)．雙歧桿菌微膠囊的研究[D]．無錫:江南大學(xué),2012

[4]Mcclements DJ．Protein-stabilized emulsions[J]．Curr Opin Colloid& Interface Sci,2004,9(5):305-313

[5]汪川,張朝武,余倩．酸奶中保加利亞乳桿菌分離條件的優(yōu)化[J]．中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,2001,13(2):73-80

[6]關(guān)海濱,喬俊纏,包小妹,等．保加利亞乳桿菌凍干保護(hù)劑的優(yōu)化[J]．中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,2013,25(2):129-131

[7]Yew SE,Lim TJ,Lew LC,et al．Development of a probiotic delivery system from agrowastes,soy protein isolate,and microbial transglutaminase[J]．JFood Sci,2011,76(3):H108-H115

[8]Lew LC,BhatR,Easa AM,etal．Developmentofprobiotic carriersusingmicrobial transglutaminase-crosslinked soy protein isolate incorporated with agrowastes[J]．JSci Food＆Agric,2011,91(8):1406-1415

[9]Picot A,Lacroix C．Encapsulation of bifidobacteria in whey proteinbasedmicrocapsulesand survival in simulated gastrointestinal conditionsand in yoghurt[J]．IntDairy J,2004,14(6):505-515

[10]Reid AA,Champagne CP,Gardner N,etal．Survival in food systemsof Lactobacillus rhamnosus R011 microentrapped in whey protein gel particles[J]．JFood Sci,2007,72(1):M031-M037

[11]魏華,李雁群,傅金衡,等．乳酸菌微囊化工藝的初步研究[J]．中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,2000,12(5):259-261

[12]Hébrard G,Blanquet S,Beyssac E,etal．Use ofwhey protein beadsas anew carrier system for recombinantyeasts in human digestive tract [J]．JBiotechnol,2006,127(1):151-160

[13]Weinbreck F,Bodnár I,Marco ML．Can encapsulation lengthen the shelf-life of probiotic bacteria in dry products[J]．Int JFood Microbiol,2010,136(3):364-367

[14]Elzoghby AO,El-Fotoh WS,Elgindy NA．Casein-based formulations aspromising controlled release drug delivery systems[J]．JControlled Release,2011,153(3):206-216

Research on the M icroencapsulation of Lactobacillus bulgaricus

GUANHai-bin，DONGZhi-heng，BAOXiao-mei，SHIRui-wen，QIAO Jun-chan*

（Pharmacy College，Inner Mongolia Medical University，Hohhot010110，Inner Mongolia，China）

To preparemicroencapsulation of Lactobacillusbulgaricus.Liquid fermentation technologywasused to prepare Lactobacillus bulgaricus，sodium alginate asmicro-capsule material.Freeze dry survival rate of microencapsulation Lactobacillus bulgaricus was 45.07%，no significant difference was found compare to traditionalmethod（survival rate44.35%）.Mimichuman gastric juiceand intestinal juice tolerance testshowed that，microcapsules survival in human gastric juice 3 hours，cell survival ratewas 71.16%，while the control survival ratewas16.47%.In the human intestinal juice，after 6 hoursmicroencapsulated cell survival ratewas 71.67%，while the control survival rate was 30.46%.Microcapsule plays a protective role for Lactobacillus bulgaricus from humangastricand intestinal juiceeffect.

Lactobacillusbulgaricus；microcapsules；alginate；survival rate

2014-05-27

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.23.017

內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目（NJZY14139）；內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2011MS1211）

關(guān)海濱（1982—），男（滿），講師，碩士研究生，從事微生物藥物、食品及制劑方面的研究。

*通信作者：?jiǎn)炭±p，男（漢），教授，本科，從事微生物藥物、生態(tài)學(xué)方面的研究。