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      微透析和高效液相色譜法測定大鼠腦內(nèi)天麻素及天麻苷元含量

      2014-07-18 11:52:37呂允鳳
      實(shí)用藥物與臨床 2014年3期
      關(guān)鍵詞:透析液腦區(qū)天麻

      呂允鳳

      ·藥學(xué)研究·

      微透析和高效液相色譜法測定大鼠腦內(nèi)天麻素及天麻苷元含量

      呂允鳳

      目的 考察不同劑量天麻素皮下及口服給藥后大鼠腦內(nèi)的天麻素及其代謝產(chǎn)物天麻苷元的濃度變化。方法 采用腦內(nèi)微透析技術(shù)進(jìn)行在體動(dòng)態(tài)取樣,建立了高效液相-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜方法測定腦透析液中的天麻素含量,建立了高效液相-二極管陣列檢測方法測定腦透析液中的天麻苷元含量。結(jié)果 兩種給藥方式大鼠不同腦區(qū)內(nèi)天麻素濃度均較低,天麻苷元腦內(nèi)濃度明顯高于其原型藥物天麻素。結(jié)論 天麻素的血腦屏障透過能力差,但其活性代謝產(chǎn)物天麻苷元能夠較好地進(jìn)入腦內(nèi)發(fā)揮作用。

      天麻素;天麻苷元;高效液相-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜;高效液相-二極管陣列檢測;微透析

      0 引言

      天麻素(Gastrodin,GAS)是我國傳統(tǒng)中藥天麻的主要有效成分,近年來被用于改善學(xué)習(xí)記憶功能和治療老年癡呆[1-2]。其代謝產(chǎn)物天麻苷元(Gastrodigenin,p-hydroxybenzyl alcohol,HBA)同樣具備對(duì)神經(jīng)的保護(hù)作用等活性[3]。腦是GAS的作用靶器官,有觀點(diǎn)認(rèn)為,其腦內(nèi)作用是通過HBA實(shí)現(xiàn)的,而目前對(duì)GAS腦內(nèi)主要存在形式及入腦情況的研究較少。本文采用微透析技術(shù)對(duì)給藥后大鼠進(jìn)行連續(xù)取樣,測定皮下及口服給藥后大鼠腦內(nèi)不同腦區(qū)GAS和HBA濃度,對(duì)GAS及其代謝產(chǎn)物的入腦情況進(jìn)行研究。

      1 儀器與試藥

      大鼠腦定位儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)、牙科直型手機(jī)(日本NSK公司)、THOMAS ISO 014牙科鉆頭(法國 BORGES公司)、B030802與B030503型微透析探針(綿陽高新區(qū)佰脈生物儀器有限公司)、Ⅱ型自凝造牙粉(上海珊瑚化工廠)、PHD2000型微量恒流泵及微量控制器(美國HARVARD公司)、Dulbecco′s磷酸緩沖鹽(美國SIGMA公司)。

      Waters2795型高效液相色譜儀(美國Waters公司)、Quattro premier串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司)、Waters996型二極管陣列檢測器(美國Waters公司)、symmetryShieldTMRP18色譜柱(2.1 mm×150 mm,3.5 μm美國Waters公司)、Waters MassLynxTM 4.0工作站(美國Waters公司)。

      麻醉用戊巴比妥鈉(純度99%,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,WS20070403)、GAS對(duì)照品(純度99.8%,中國藥品生物制品檢定所,110807-200205)、HBA對(duì)照品(純度99.4%,中國藥品生物制品檢定所,110896-200001)、甲酸(美國SIGMA公司)、甲酸胺(美國SIGMA公司)、甲醇(HPLC級(jí),美國TEDIA公司)、乙腈(ABSOLVE級(jí),美國TEDIA公司)。

      實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雄性Sprague-Dawley大鼠(北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心維通利華公司提供),250~300 g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SYXK(京)2003-0008。

      2 方法與結(jié)果

      2.1 大鼠腦內(nèi)微透析方法[4-6]Dulbecco′s灌流液的配制:取Dulbecco′s磷酸緩沖鹽加水及CaCl2溶液配制成含138 mmol/L NaCl,8.1 mmol/L Na2HPO4,2.7 mmol/L KCl,1.5 mmol/L KH2PO4,0.5 mmol/L MgCl2和1.2 mmol/L CaCl2,pH值7.4的緩沖溶液。

      藥物配制及給藥分組:SD大鼠共48只,分為皮下給藥組和灌胃給藥組。皮下給藥組分為3個(gè)劑量組,每組12只,分別為10 mg/kg組、30 mg/kg組、50 mg/kg組;灌胃組12只,為50 mg/kg劑量組。每只大鼠均進(jìn)行中層額前皮質(zhì)(mPFC)、伏核(NAC)和海馬(HIP)腦區(qū)的手術(shù)。

      大鼠手術(shù)操作:將大鼠麻醉后,分別在腦內(nèi)mPFC、NAC及HIP腦區(qū)植入探針導(dǎo)管。以1.5 μL/min灌流速度進(jìn)行取樣,在收集1個(gè)空白樣品(每次30 min)透析穩(wěn)定后,以此點(diǎn)為零時(shí)間點(diǎn),經(jīng)皮下給藥管或灌胃給予一定劑量的藥物,于第30、60、90、120、150、180、210、240、270、300 min換收集管收集透析液。

      2.2 腦透析液中GAS分析方法的建立[7]GAS儲(chǔ)備液及標(biāo)準(zhǔn)液的配制:準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度為5 mg/mL的GAS對(duì)照品儲(chǔ)備液。然后采用甲醇作為稀釋液,將儲(chǔ)備液稀釋后,制成濃度為0.5、1.0、5.0、10.0、50、100、500、1 000 μg/mL的GAS標(biāo)準(zhǔn)工作液。以唑吡坦配制250 ng/mL內(nèi)標(biāo)溶液備用。

      2.2.1 色譜條件 美國Waters公司symmetryShieldTMRP18色譜柱(2.1 mm×150 mm,3.5 μm)。選用含0.05%甲酸和2 mM甲酸胺的水(A)-含0.05%甲酸和2 mM甲酸胺的甲醇(B)系統(tǒng)作為流動(dòng)相。采用梯度洗脫。起始比例為A∶B=97.5∶2.5,0 min開始,B相以變化曲線2的速率從2.5%上升到90%(0~2 min),維持該比例8 min(2~10 min),10 min起B(yǎng)相比例在1 min內(nèi)回復(fù)到起始的2.5%,最后A∶B=97.5∶2.5水平維持4 min,整個(gè)分析時(shí)間為15 min,梯度流速恒定為0.2 mL/min,柱溫為25 ℃,進(jìn)樣量20 μL。內(nèi)標(biāo)和GAS對(duì)照品的保留時(shí)間分別為4.72 min和4.37 min。

      2.2.2 質(zhì)譜條件 ESI+離子源;掃描范圍m/z 100~1 000;毛細(xì)管電壓3.0 kV;錐孔電壓25 V;離子源溫度105 ℃;脫溶劑氣(N2)溫度350 ℃;流速60 μL/min;碰撞氣(Ar)流速0.25 mL/min;碰撞誘導(dǎo)電壓(CID)分別為15 V(GTD)、20 V(LZH)和20 V(IS)。MRM檢測:m/z 303.9→m/z 106.7(GTD)、m/z 136.8→m/z 54.9(LZH)和m/z 308.2→m/z 235.0(IS)。

      2.2.3 方法的專屬性考察 將內(nèi)標(biāo)色譜圖(圖1A)、GAS色譜圖(圖1B)及空白腦透析液色譜圖(圖1C)進(jìn)行比較。由圖可見,基線噪音較小,藥物及內(nèi)標(biāo)峰形良好,無雜質(zhì)峰干擾。說明本方法具有較高的專屬性。

      圖1 色譜圖

      2.2.4 線性關(guān)系考察 配制濃度為0.05、0.10、0.50、1.0、5.0、10、50、100、500、1 000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以樣品與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比(R)和樣品的濃度(C)做線性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,權(quán)重系數(shù)為1/X,線性范圍為0.05~1 000 ng/mL,回歸方程為Y=0.050 6X+0.169 8,r=0.999 8。檢測限和定量限分別以信噪比S/n=3∶1和S/n=10∶1計(jì)。在腦透析液中,定量下限低于0.05 ng/mL,最低檢測限和定量限分別約為0.028 ng/mL和0.040 ng/mL。

      2.2.5 回收率與精密度 配制3個(gè)濃度分別為500.0、10.00、0.100 0 ng/mL的質(zhì)控樣品(QC)溶液各5份,考察日內(nèi)精密度、日間精密度并計(jì)算相對(duì)回收率。各質(zhì)控日內(nèi)日間精密度RSD均小于4%,相對(duì)回收率(%)分別為(99.7±2.1)、(101.4±2.7)和(101.2±1.6)。

      穩(wěn)定性考察:GAS透析液樣品在4 ℃環(huán)境下至少能穩(wěn)定放置24 h,GAS透析液樣品在-70 ℃冰凍環(huán)境下至少能穩(wěn)定放置12周,反復(fù)凍融3次后仍保持穩(wěn)定。體外增量法測得兩種型號(hào)微透析探針對(duì)GAS的回收率分別為19.97%和23.06%。

      2.3 腦透析液中HBA測定方法的建立 HBA標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度為5 mg/mL的HBA對(duì)照品儲(chǔ)備液。用超純水將儲(chǔ)備液稀釋后,制成濃度為50、100、500、1 000、5 000、10 000 ng/mL的HBA標(biāo)準(zhǔn)工作液。

      2.3.1 色譜條件 使用美國Waters公司symmetryShieldTMRP18色譜柱(2.1 mm×150 mm,3.5 μm)。選用了含0.05%甲酸和2 mM甲酸胺的水(A)-乙腈(B)系統(tǒng)作為流動(dòng)相。檢測波長為220 nm。采用梯度洗脫過程。起始比例為A∶B=90∶10,0 min開始,B相以勻速從10%上升到73%(0~2 min),維持該比例7 min(2~9 min),9 min起B(yǎng)相比例在1 min內(nèi)回復(fù)到起始的10%,最后A∶B=90∶10水平維持5 min,整個(gè)分析時(shí)間為15 min,梯度流速恒定為0.22 mL/min,柱溫為25 ℃,取腦透析液樣品20 μL,加入20 μL超純水,混勻,進(jìn)樣量20 μL。HBA對(duì)照品的保留時(shí)間為6.61 min。

      2.3.2 方法的專屬性 將HBA對(duì)照品液加入空白腦透析液中的色譜圖(圖2A)與空白腦透析液色譜圖(圖2B)進(jìn)行比較??梢娀€噪音較小,HBA峰形良好,無雜質(zhì)峰干擾。說明本方法具有較高的專屬性。

      圖2 色譜圖

      2.3.3 線性關(guān)系考察 配制濃度為5.0、10、50、100、500、1 000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液測定。以樣品峰面積和樣品的濃度做線性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,權(quán)重系數(shù)為1/X,線性范圍為5~1 000 ng/mL,回歸方程Y=167.3X-859.4,r=0.999 8。

      2.3.4 檢測限和定量限 分別以信噪比S/n=3∶1和S/n=10∶1計(jì)。在腦透析液中,最低檢測限和定量限分別約為0.310 ng/mL和1.030 ng/mL。

      2.3.5 回收率與精密度 配制5.0、50、500 ng/mL3個(gè)濃度的HBA質(zhì)控樣品,考察HBA回收率與精密度。各質(zhì)控日內(nèi)日間精密度RSD%均小于2%,相對(duì)回收率(%)分別為(100.4±1.4)、(99.9±1.3)和(100.7±1.2)。

      2.3.6 穩(wěn)定性考察 HBA透析液樣品在4 ℃環(huán)境下至少能穩(wěn)定放置24 h,HBA透析液樣品在-70 ℃冰凍環(huán)境下至少能穩(wěn)定放置12周,反復(fù)凍融3次后仍保持穩(wěn)定。體外增量法測得兩種型號(hào)探針對(duì)HBA的回收率分別為18.76%和23.31%。

      2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 皮下給藥后不同腦區(qū)內(nèi)(mPFC、NAC、HIP)GAS和HBA藥時(shí)曲線的比較見圖3。

      圖3 大鼠皮下給予GAS 10、30、50 mg/kg后,各腦區(qū)GAS和HBA的濃度-時(shí)間(C-T)曲線圖

      口服給藥50 mg/kg GAS后,不同腦區(qū)內(nèi)(mPFC、NAC、HIP)GAS和HBA藥時(shí)曲線的比較見圖4。

      圖4 大鼠口服給予50 mg/kg GAS后,各腦區(qū)GAS和HBA的濃度-時(shí)間(C-T)曲線圖

      由結(jié)果可見,GAS皮下給藥后,腦內(nèi)藥物濃度呈劑量相關(guān)性,但總體腦內(nèi)濃度很低,給藥1~2 h內(nèi)達(dá)最高濃度,3個(gè)腦區(qū)內(nèi)的藥物分布不存在顯著差異??诜o藥后,透過血腦屏障的藥物量略高于皮下給藥。各腦區(qū)藥物分布無顯著差異,腦內(nèi)藥物峰濃度平均值與體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)中體內(nèi)藥物峰濃度相比,占體內(nèi)藥物濃度的比例低于0.2%??梢?,GAS的血腦屏障透過率極低。GAS皮下給藥后,腦內(nèi)HBA濃度與給藥量呈劑量相關(guān)性,給藥90 min內(nèi)達(dá)最高濃度,3個(gè)腦區(qū)內(nèi)的藥物分布不存在顯著差異。灌胃給藥后,大鼠腦內(nèi)HBA于給藥后90 min達(dá)峰,各腦區(qū)分布NAC中較mPFC與NAC中略低但差異不大。無論皮下給藥還是灌胃給藥,腦內(nèi)HBA濃度均顯著高于GAS濃度水平(P<0.001)。

      3 討論

      本文建立了靈敏準(zhǔn)確的GAS和HBA定量檢測方法,配合微透析取樣技術(shù)對(duì)大鼠不同腦區(qū)的原型藥物GAS及其主要活性代謝產(chǎn)物HBA進(jìn)行了連續(xù)檢測。

      大鼠皮下給予GAS后,30 min高劑量組能夠檢出GAS,而低劑量組幾乎檢測不到GAS的存在,1~2 h內(nèi)腦內(nèi)各腦區(qū)的GAS都達(dá)到最高濃度,各劑量組腦中藥物濃度亦呈劑量相關(guān)性,但各腦區(qū)內(nèi)含量都很低,各腦區(qū)之間無顯著差異。灌胃給藥后,GAS在各腦區(qū)內(nèi)于1.5 h達(dá)峰,峰濃度略高于皮下給藥,但仍然低于100 ng/mL。灌胃給藥GAS血中的達(dá)峰時(shí)在0.5 h以內(nèi),可見腦內(nèi)達(dá)峰時(shí)滯后較長時(shí)間。腦內(nèi)峰濃度與同劑量血中峰濃度相比,低于0.2%。說明GAS雖然能夠透過血腦屏障,但透過率很低。

      建立了HBA的腦內(nèi)透析液中的測定方法,結(jié)果發(fā)現(xiàn),給予GAS后,腦內(nèi)HBA的含量是GAS含量的6~10倍。皮下給藥時(shí),30 min各劑量組都能測得HBA的存在,1.5 h腦內(nèi)HBA達(dá)峰,各腦區(qū)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這與皮下給藥后腦內(nèi)DA和ACh的升高峰值時(shí)間相符合,說明GAS給藥后產(chǎn)生的腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)作用可能與其代謝產(chǎn)物HBA入腦及其活性有關(guān)。

      灌胃給予GAS后,腦內(nèi)HBA在各腦區(qū)的分布均勻,達(dá)峰時(shí)約為1.5 h,同樣滯后于血中藥物達(dá)峰時(shí),可能是由體內(nèi)代謝過程和透過血腦屏障的過程造成其達(dá)峰時(shí)的滯后。

      微透析技術(shù)在腦內(nèi)藥物濃度研究過程中具有連續(xù)取樣動(dòng)態(tài)監(jiān)測的優(yōu)勢,但限于其取樣量低、探針回收率低等缺點(diǎn),導(dǎo)致其測得的藥物濃度絕對(duì)量可能存在誤差。因此,本文僅針對(duì)數(shù)據(jù)的相對(duì)變化趨勢及相對(duì)量進(jìn)行比較。另外,由于微透析取樣為階段取樣(30 min),因此,各時(shí)間點(diǎn)藥物濃度反映的實(shí)際為此時(shí)間點(diǎn)之前30 min內(nèi)的平均濃度[8]。

      [1] 楊汀,樊光輝.天麻素治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病機(jī)制研究進(jìn)展[J].華南國防醫(yī)學(xué)雜志,2013,27(2):131-132.

      [2] 柳星,汪萌芽.天麻素對(duì)海馬內(nèi)Aβ1-40注射阿爾茨海默病模型大鼠學(xué)習(xí)記憶的改善作用[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2012,17(4):408-411.

      [3] MW Laschke,AE Vorsterman van Oijen,C Scheuer,et al.In vitro and in vivo evaluation of the anti-angiogenic actions of 4-hydroxybenzyl alcohol[J].British Journal of Pharmacology,2011,163(4):835-844.

      [4] 聶穎蘭,范斌,閆寒,等.微透析與現(xiàn)代分析技術(shù)在線聯(lián)用的研究進(jìn)展[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012,18(5):252-255.

      [5] 馬張慶,陶芳,方浩,等.應(yīng)用微透析技術(shù)研究鹽酸曲馬多在小鼠額葉皮質(zhì)細(xì)胞外液中的藥動(dòng)學(xué)[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2013,48(3):406-410.

      [6] 曹陽,程巧鴛,盧紅陽,等.LC-MS/MS法測定大鼠腦微透析液中7-乙基-10-羥基喜樹堿的濃度[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2013,42(1):98-102.

      [7] 魏元鋒,林曉,張寧,等.大川芎方效應(yīng)組分血中移行成分UPLC-MS分析[J].中國中藥雜志,2011,36(9):1175-1178.

      [8] 時(shí)正媛,胡欣,陳曉輝,等.微透析法研究活體大鼠腦內(nèi)左旋奧硝唑藥動(dòng)學(xué)[J].中國藥學(xué)雜志,2011,46(22):1661-1664.

      Microdialysis and HPLC method for the determination of gastrodin and gastrodigenin in rat brain

      Lü Yun-feng

      (Center for Medical Device Evaluation,SFDA,Beijing 100044,China)

      Objective To detect the level of gastrodin and its metabolites gastrodigenin in rat brain dialysate after subcutaneous or oral administration of different doses of gastrodin.Methods Gastrodin in rat brain dialysate was determined by HPLC-MS/MS method and gastrodigenin was determined by HPLC-diode array detector method.Results The gastrodin levels in different rat brain regions for both subcutaneous and oral administration were low while the concentration of gastrodigenin in rat brain was significantly higher than gastrodin.Conclusion The results show that gastrodin could hardly pass through the blood-brain barrier,but its active metabolites gastrodigenin has a greater ability to penetrate the blood-brain barrier and play a role in brain.

      Gastrodin;Gastrodigenin;LC-MS/MS;HPLC-diode array detector;Microdialysis

      2013-06-03

      國家食品藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心,北京 100044

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