從枇杷內(nèi)生真菌中篩選抗枇杷根腐病菌的活性菌株

魯海菊　董梅　崔同敏　陸林和　趙杰

摘要：采用對峙培養(yǎng)法，從97株枇杷內(nèi)生真菌中篩選出對枇杷根腐病病菌有拮抗活性的菌株。結(jié)果表明，97株真菌對枇杷根腐病病菌均有一定的抑制效果，抑制率≥60%的菌株有25株，在50%～59%之間的菌株共30株，在50%以下的菌株42株。抑制率在50%以上的菌株共55株，占總數(shù)的56.7%，其中P3.9、YPG4、PGSC3′、YPLY1、YPLY2、YPG1、DPG3、DPG4和DPG6等 9株菌株的抑制率均在70%及以上，P3.9和YPG4 等2株菌株抑菌率分別達(dá)到88%、82%。

關(guān)鍵詞：枇杷；根腐??；內(nèi)生真菌；抑菌活性

中圖分類號：S436.67+9文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1002-1302（2014）01-0095-03

收稿日期：2013-04-26

基金項目：云南省大學(xué)生創(chuàng)新試驗計劃；紅河學(xué)院博碩項目（編號：XJ1B0912）；云南省高校“農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高效栽培與安全控制重點實驗室”建設(shè)經(jīng)費；紅河學(xué)院碩士點植物保護(hù)一級學(xué)科建設(shè)項目。

作者簡介：魯海菊（1978—），女，云南大理人，博士研究生，副教授，主要從事亞熱帶植物真菌分類和真菌病害研究。E-mail：luhaiju2011@126.com。枇杷[Eriobotrya japonica （Thunb.） L.]為薔薇科喬木，是南方主要果樹之一。隨著栽種面積不斷擴大，枇杷受到各種真菌病害不同程度的危害，嚴(yán)重影響了枇杷的品質(zhì)和產(chǎn)量。在《中國真菌總匯》中記載了我國枇杷圓斑?。≒hyllosticta eriobotryae）、灰斑?。≒estalotia eribotryae）、炭疽?。℅lomerella cingulata）等18種真菌性病害[1]，中國臺灣發(fā)現(xiàn)枇杷角斑?。–ercospora eribotryae）等9種真菌性病害[2]，福建省報道枇杷污葉?。–lasterosporium eriobotryae）等13種真菌性病害[2-3]，截至2005年，我國共報道42種枇杷真菌性病害[4]。據(jù)筆者調(diào)查可知，云南蒙自有5種枇杷真菌性病害，分別為圓斑病、灰斑病、角斑病、炭疽病和根腐病。其中根腐病尤其嚴(yán)重，它是由枇杷葉擬盤多毛孢（Pestalotiopsis eriobotrifolia）引起的一種土傳真菌病害。自2005年以來，蒙自枇杷根腐病在各產(chǎn)區(qū)嚴(yán)重發(fā)生，發(fā)病率超過40%，嚴(yán)重制約著當(dāng)?shù)罔凌水a(chǎn)業(yè)的發(fā)展。枇杷根腐病病原菌的種類各地區(qū)報道不一致，中國臺灣報道的根腐病是由寄生疫霉（Phytophthora parasitica）引起的[5]，福建莆田報道的由帚梗柱孢屬（Cylindrocladium sp.）引起[6]。而筆者所在的研究組將云南蒙自枇杷根腐病病原菌初步鑒定為枇杷葉擬盤多毛孢（P. eriobotrifolia）。據(jù)文獻(xiàn)報道，枇杷葉擬盤多毛孢也是枇杷葉部灰斑病[2]和枇杷花腐病[7]的病原菌。枇杷根腐病無論是由哪種真菌引起的，其共同點都是土傳真菌病害?；瘜W(xué)防治對于土傳病害收效甚微，加上化學(xué)農(nóng)藥不符合綠色農(nóng)業(yè)生產(chǎn)要求，生物防治日趨受到人們的重視。內(nèi)生真菌是一類在健康植物組織內(nèi)定殖但不會引起病害癥狀的真菌[8]，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。李雅等以蘋果腐爛病菌（Cytospora sp.）、番茄灰霉病菌（Botrytis cintrea）、西瓜枯萎病菌（ Fusarium oxysporium f. sp. niveum ）、黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporium f. sp. cucumerinum）、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）和白菜黑斑病菌（Alternaria brassicae）為供試菌種，對杜仲（Eucom miaulmoides）的49株內(nèi)生真菌及其次生代謝物進(jìn)行抑菌活性測定，結(jié)果表明，有9株內(nèi)生真菌對6種測試菌都有抑制作用，4株內(nèi)生菌的次生代謝產(chǎn)物對6種測試菌都有抑制作用[9]。對除蟲菊[10]、冬青衛(wèi)矛[11]、連翹[12]、海金沙[13]、喜樹[14]和杜仲[15]內(nèi)生真菌也開展過類似的生物防治研究。因此，本試驗試圖從枇杷根、莖、葉和果實中分離到的97株內(nèi)生真菌中篩選出對枇杷根腐病病菌有拮抗活性的菌株，為枇杷根腐病土傳真菌病害的有效、可持續(xù)防控提供生防菌種資源。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1枇杷內(nèi)生真菌及枇杷根腐病病原菌筆者所在的實驗室從蒙自枇杷園區(qū)采集枇杷根、主干、枝條、老葉、新葉、果實及根腐病病樣，常規(guī)組織分離[16]獲得供試菌株。

1.1.2供試培養(yǎng)基供試培養(yǎng)基為PDA：馬鈴薯200 g、葡萄糖16 g、瓊膠 20 g、蒸餾水1 000 mL。

1.2方法

1.2.1對峙培養(yǎng)將已分離純化病原菌和內(nèi)生真菌菌株在PDA平板培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫擴大培養(yǎng)7 d，采用對峙培養(yǎng)法[17]在培養(yǎng)基同一半徑周圍用打孔器取直徑為5 mm的菌絲塊，分別接種于無菌PDA平板（直徑90 mm）中，2個接種點相距40 mm，以不接種供試菌株作為對照，設(shè)3次重復(fù)，在 28 ℃ 下恒溫培養(yǎng)，7 d后測定病原菌的菌落直徑，計算其生長抑制率：抑制率=（dCK-dB）/dCK×100%，其中dCK表示對照病原菌菌落直徑，dB表示處理病原菌菌落直徑。

1.2.2數(shù)據(jù)統(tǒng)計所有試驗數(shù)據(jù)均采用 SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計，經(jīng) Duncans多重比較各處理間的差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1抑制率≥60%的菌株的抑制效果

2.2抑制率在50%～59%之間的菌株的抑制效果

表2顯示，30株菌株與病原菌對峙培養(yǎng)7 d后，病原菌菌落生長直徑與對照直徑差異極顯著（P<0.01），表明這30株菌株對病原菌有很強的抑制效果，且其抑制率在50%～59%之間。

2.3抑制率在50%以下的菌株數(shù)量及其抑制效果

表3顯示，42株菌株與病原菌對峙培養(yǎng)7 d后，病原菌菌落生長直徑與對照差異極顯著，表明這42株菌株對病原菌有抑制效果。

3結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，分離自枇杷根、莖、葉和果中的內(nèi)生真菌對其根腐病病菌都表現(xiàn)出一定的抑制效果，其中抑制率在70%以上的9株菌株中來自根部的5株，占55.6%；來自葉片的2株，占22.2%；來自主干和果實的各1株，各占 11.1%。說明枇杷各個器官都存在抑制根腐病病菌的內(nèi)生真菌（花中有待研究），但其根部存在的菌株占大多數(shù)。

枇杷根腐病癥狀表現(xiàn)為：初期樹勢衰退，葉片起初變黃，變成褐色之后脫落；莖基部腐爛，莖干呈暗褐色，根部環(huán)腐，不長新根。雖然根部存在大量抑制其根腐病病菌的內(nèi)生真菌，

表2抑制率在50%～59%之間的菌株抑制效果但是根還是遭到病原菌的侵染危害。本試驗的供試內(nèi)生真菌中除了P3.9是在分離枇杷根腐病病原菌的過程中無意間從病樣中分離獲得之外，其余菌株都是從健康枇杷植株中分離獲得的。病株根部是否存在抑制其根腐病病菌的菌株呢？如何做到健康植株根部存在的拮抗菌大量定殖，讓其免遭病原菌的侵染危害？這些問題都是今后需要進(jìn)一步研究的課題。P3.9菌株經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為木霉屬（Trichoderma）的真菌，對枇杷根腐病病菌的抑制率達(dá)到88%。木霉菌是全球普遍應(yīng)用的生防真菌，主要用于防治各類植物的土傳病害[18]，至少對18屬20 余種病原菌有拮抗作用[19]。另外，武漢琴等曾報道茶樹內(nèi)生木霉在其體內(nèi)成功定殖[20]。本試驗中，P3.9木霉菌株分離自枇杷主干韌皮部，應(yīng)屬于內(nèi)生真菌，如果它能在枇杷各個器官中大量定殖，就可以發(fā)揮內(nèi)生菌作為生防菌獨有的優(yōu)勢：其一，專一性很強，除了對其宿主植物及取食或感染宿主植物的生物起作用外，對其他生物沒有直接影響；其二，可人工接種導(dǎo)入不同的植物并通過宿主的種子進(jìn)行遺傳[21]；其三，在植物組織內(nèi)有足夠的碳源、氮源，還受植物組織的良好保護(hù)，具有更穩(wěn)定的生存環(huán)境，更易于發(fā)揮生防作用[22]。因此，P3.9具有廣闊的應(yīng)用前景，為枇杷根腐病的生物防治提供了菌種資源。

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