李旭艷　邵淑麗　張偉偉　惲東澤　付博　張珍珠

摘要：通過(guò)pSilencer 2.1質(zhì)粒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)沉默急性早幼粒白血病耐藥HT9細(xì)胞的耐藥基因mdr1表達(dá)，可提高耐藥細(xì)胞對(duì)姜黃素的敏感性。通過(guò)設(shè)計(jì)合成靶向mdr1基因的shRNA干擾片段，定向克隆到pSilencer 2.1-U6 neo質(zhì)粒中，成功構(gòu)建沉默mdr1基因特異表達(dá)的shRNA表達(dá)載體，電轉(zhuǎn)染HT9細(xì)胞后篩選陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot檢測(cè)細(xì)胞mdr1基因表達(dá)情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)P-糖蛋白外排泵功能，MTT法和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞對(duì)藥物敏感性和細(xì)胞周期分布。結(jié)果顯示，構(gòu)建的shRNA表達(dá)載體pU6/shRNA/mdr1轉(zhuǎn)染HT9細(xì)胞后，HT9/pU6/shRNA細(xì)胞mdr1 mRNA表達(dá)降低了78.84%（P<0.01），P-糖蛋白的表達(dá)量降低了48.27%（P<0.05），細(xì)胞內(nèi)Rho123相對(duì)熒光強(qiáng)度由10.8%±058%升高至73.56%±1.37%；轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)姜黃素敏感性明顯增強(qiáng)，IC50由（24.10±0. 83） μmol/L降至（5.10±014） μmol/L；耐藥相對(duì)逆轉(zhuǎn)率為84.74%±1.86%，與HT9細(xì)胞相比，經(jīng)姜黃素處理的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞HT9/pU6/shRNA細(xì)胞周期阻滯在S、G2/M期。說(shuō)明質(zhì)粒介導(dǎo)的shRNA表達(dá)載體pU6/shRNA/mdr1能夠穩(wěn)定、持久地抑制mdr1基因表達(dá)，能有效增強(qiáng)HT9細(xì)胞對(duì)姜黃素的敏感性。

關(guān)鍵詞：shRNA；pSilencer 2.1-U6 neo質(zhì)粒；多藥耐藥性；HT9細(xì)胞；姜黃素

中圖分類號(hào)：R961文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2014）01-0022-04

收稿日期：2013-06-06

基金項(xiàng)目：黑龍江省自然科學(xué)基金（編號(hào)：C200624）；黑龍江省教育廳科技項(xiàng)目（編號(hào)：11511447、12511611）。

作者簡(jiǎn)介：李旭艷（1982—），女，山東陽(yáng)谷人，碩士，講師，從事分子生物學(xué)研究。Tel：（0452）2742695；E-mail：lxy0702@126.com。

通信作者：邵淑麗，博士，教授，從事分子生物學(xué)研究。Tel：（0452）2738219；E-mail：shshl32@163.com。近年來(lái)，白血病的治愈率已有明顯提高，但由于白血病細(xì)胞中存在多種耐藥相關(guān)基因異常的高表達(dá)，致使白血病細(xì)胞對(duì)抗癌藥物產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致部分白血病患者治療失敗或在化療后復(fù)發(fā)。研究表明，多藥耐藥基因mdr1的過(guò)表達(dá)成為經(jīng)典的多藥耐藥表型[1-2]。mdr1基因的表達(dá)產(chǎn)物P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）可以利用ATP水解釋放的能量將化療藥物泵出細(xì)胞外，使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度始終維持在低水平，使藥物的細(xì)胞毒作用減弱，從而導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性[1]。P-糖蛋白對(duì)藥物的特異性很小，能夠運(yùn)輸多種結(jié)構(gòu)不同的底物，如長(zhǎng)春新堿、蒽環(huán)類藥物（柔紅霉素、阿霉素）、姜黃素、紫杉醇等，因此耐藥細(xì)胞能對(duì)許多結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的藥物產(chǎn)生耐性。目前，RNA干擾（RNA interference，RNAi） 已用于沉默腫瘤細(xì)胞耐藥基因表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[3-4]。本試驗(yàn)以質(zhì)粒pSilencer 2.1-U6 neo為基礎(chǔ)，成功構(gòu)建了shRNA表達(dá)載體pU6/shRNA/mdr1，轉(zhuǎn)染早幼粒白血病耐藥HT9細(xì)胞，觀察細(xì)胞mdr1基因表達(dá)情況、蛋白功能及細(xì)胞對(duì)姜黃素敏感性的變化。

1材料與方法

1.1材料

pSilencer 2.1-U6 neo由北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司惠贈(zèng)，人急性早幼粒白血病細(xì)胞株HL60、耐三尖杉酯堿的HL60細(xì)胞株HT9由北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供，RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，鼠抗人單克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗鼠二抗為北京中山金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。ECM830型電穿孔儀（BTX）；熒光定量RCP儀（Bio-Rad）；流式細(xì)胞儀FC500（Beckman）；7700 Real-Time PCR 儀（ABI）。

1.2方法

1.2.1pU6/shRNA/mdr1載體的構(gòu)建根據(jù)GenBank P-糖蛋白編碼基因mdr1 mRNA的已知序列（NM_000927），選擇1 個(gè)shRNA特異性靶位點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)合成編碼shRNA的DNA模板序列：正義鏈GATCCGGAGGCCAACATACATGCCTTCAAGAGAGGCATGTATGTTGGCCTCCTTTTTTGGAAA；反義鏈AGCTTTTCCAAAAAAGGAGGCCAACATACATGCCTCTCTTGAAGGCATGTATGTTGGCCTCCG，退火形成雙鏈，將其定向克隆到 pSilencer2.1-U6 neo載體上，shRNA重組質(zhì)粒命名為 pU6/shRNA/mdr1。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證插入序列無(wú)突變。大量提取純化質(zhì)粒，待轉(zhuǎn)染。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染HT9細(xì)胞用含1.0 μg/mL三尖杉酯堿的培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，試驗(yàn)前2 周取出三尖杉酯堿培養(yǎng)細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT9細(xì)胞，利用線性化的 pEGFP-N1質(zhì)粒優(yōu)化電轉(zhuǎn)染條件，線性化的pSilencer 2.1-U6 neo 空質(zhì)粒、pU6/shRNA/mdr1重組質(zhì)粒于最佳電轉(zhuǎn)染條件下轉(zhuǎn)染HT9細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞為HT9/pU6（空載體對(duì)照轉(zhuǎn)染細(xì)胞）、HT9/pU6/shRNA（轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒細(xì)胞），轉(zhuǎn)染后用 600 μg/mL G418篩選建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HT9細(xì)胞克隆，有限稀釋法挑取單克隆轉(zhuǎn)染細(xì)胞。試驗(yàn)另設(shè)非耐藥對(duì)照細(xì)胞HL60，耐藥非轉(zhuǎn)染對(duì)照細(xì)胞HT9。

1.2.3Real-time PCR檢測(cè)mdr1 mRNA表達(dá)量采用UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，用Real-time PCR檢測(cè)以上細(xì)胞mdr1基因的表達(dá)量。反應(yīng)體系為25 μL：上、下游引物各0.25 μL，SYBR Green Ⅰ 1 μL，ddH2O 18 μL，cDNA 0.5 μL。循環(huán)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸。反應(yīng)在ABI 7700 Real Time PCR儀上進(jìn)行，以β-actin作為內(nèi)參對(duì)照，引物序列具體情況見(jiàn)表1。表1引物序列與擴(kuò)增片段長(zhǎng)度

引物名稱1引物序列（5′→3′）1擴(kuò)增片段長(zhǎng)度（bp）mdr11F：ATATCAGCAGCCCACATCAT；R：GAAGCACTGGGATGTCCGGT1154β-actin1F：ATCATGTTTGAGACCTTCAACA；R：CATCTCTTGCTCGAAGTCCA1318

1.2.4P-糖蛋白表達(dá)量的Western blot檢測(cè)提取各組細(xì)胞總蛋白，測(cè)定樣品純度，再進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入鼠抗人P-糖蛋白單克隆抗體C219（1 ∶40），室溫孵育1.5 h，PBS洗膜，HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗（1 ∶5 000），室溫孵育1.5 h，ECL發(fā)光液顯影、定影、洗片，用凝膠圖像分析軟件分析X光片灰度值。

1.2.5FCM檢測(cè)P-糖蛋白外排泵功能收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組細(xì)胞，分別與10 μg/mL Rho123混勻，37 ℃孵育 30 min，用預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞，再重懸于預(yù)冷的PBS中，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Rho123熒光強(qiáng)度。

1.2.6MTT法檢測(cè)耐藥細(xì)胞對(duì)姜黃素敏感性收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，按接種量1萬(wàn)個(gè)/孔接種于96 孔中，常規(guī)條件下分別與8個(gè)濃度梯度的姜黃素培養(yǎng)48 h，每個(gè)濃度3個(gè)平行，采用常規(guī)四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（MTT法）于570 nm下測(cè)定吸光度D，計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=D試驗(yàn)組/D對(duì)照組×100%，以藥物濃度為橫軸，細(xì)胞存活率為縱軸繪制濃度效應(yīng)曲線，求出回歸方程，確定半數(shù)抑制濃度（IC50），并計(jì)算相對(duì)逆轉(zhuǎn)率：逆轉(zhuǎn)率=[IC50（A）-IC50（B）]/[IC50（A）-IC50（C）]×100%，IC50（A）、IC50（B）、IC50（C）分別代表逆轉(zhuǎn)前耐藥細(xì)胞、逆轉(zhuǎn)后耐藥細(xì)胞和親本敏感細(xì)胞的IC50。

1.2.7FCM檢測(cè)細(xì)胞周期取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組細(xì)胞100萬(wàn)個(gè)，接種100 mL 培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，分別加入終濃度為8.0 μmol/L姜黃素，培養(yǎng)48 h，800 r/min離心10 min收集細(xì)胞，與1 mL預(yù)冷的70%乙醇充分混勻，4 ℃保存，至少固定18 h，細(xì)胞濃度調(diào)整為100萬(wàn)個(gè)/mL，洗滌，重懸于1 mL含 20 μg/mL RNase A和50 μg/mL PI的染液中，37 ℃孵育30 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。

1.3數(shù)據(jù)處理

用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，進(jìn)行單因素方差分析，組間差異性分析采用LSD法，數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2結(jié)果與分析

2.1pU6/shRNA/mdr1重組載體對(duì)mdr1-mRNA表達(dá)的影響

熒光定量PCR結(jié)果（圖1）顯示，HT9/pU6/shRNA細(xì)胞的mRNA 相對(duì)表達(dá)量極顯著低于HT9 細(xì)胞、HT9/pU6細(xì)胞；與HT9 細(xì)胞相比，HT9/pU6/shRNA 細(xì)胞mdr1基因的相對(duì)表達(dá)量降低了78.84% （P<0.01）；HT9/pU6與HT9 細(xì)胞的mRNA 相對(duì)表達(dá)量差異不顯著（P>0.05）；HT9/pU6/shRN與HL60細(xì)胞mRNA 相對(duì)表達(dá)量差異顯著（P<0.05）。說(shuō)明

重組質(zhì)粒pU6/shRNA/mdr1對(duì)HT9 細(xì)胞目的基因mdr1的表達(dá)有一定的干擾作用，而空載體對(duì)目的基因表達(dá)無(wú)干擾作用。

2.2pU6/shRNA/mdr1重組載體對(duì)P-糖蛋白表達(dá)的影響

用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)P-糖蛋白水平，以其與內(nèi)參β-actin的比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果（圖2）顯示，HT9/pU6/shRNA細(xì)胞的P-糖蛋白表達(dá)量比HT9細(xì)胞低48.27%（P<0.05），HT9/pU6細(xì)胞與HT9 細(xì)胞蛋白相對(duì)表達(dá)量差異不顯著（P>0.05），HT9/pU6/shRNA細(xì)胞與HL60細(xì)胞蛋白相對(duì)表達(dá)量差異顯著（P<0.05）。證實(shí)了重組質(zhì)粒pU6/shRNA/mdr1對(duì)HT9 細(xì)胞mdr1基因沉默的有效性。

2.3pU6/shRNA/mdr1重組載體對(duì)P-糖蛋白外排泵功能的影響

經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析（表2）可知，與HT9細(xì)胞相比，HT9/pU6/shRNA 細(xì)胞的Rho123熒光強(qiáng)度極顯著增強(qiáng)（P<001），而HT9/pU6細(xì)胞內(nèi)Rho123熒光強(qiáng)度變化不顯著（P>005）；HT9/pU6/shRNA細(xì)胞與 HL60細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度差異極顯著（P<0.01）。說(shuō)明轉(zhuǎn)染后的單克隆細(xì)胞 HT9/pU6/shRNA 的P-糖蛋白外排泵功能極顯著增強(qiáng)。

2.4RNAi對(duì)HT9細(xì)胞的影響

HT9細(xì)胞的IC50與HL60細(xì)胞差異顯著，進(jìn)一步說(shuō)明HT9 細(xì)胞具有高度耐藥性。姜黃素藥物濃度與細(xì)胞存活率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，相同作用條件下，HT9/pU6/shRNA細(xì)胞存活率降低最明顯。與HT9 細(xì)胞相比，HT9/pU6/shRNA細(xì)胞對(duì)姜黃素的IC50極顯著降低（P<0.01），而HT9/pU6細(xì)胞對(duì)姜黃素的IC50降低但差異不顯著（P>0.05）；HT9/pU6/shRNA細(xì)胞對(duì)姜黃素的IC50與HL60細(xì)胞差異極顯著（P<001），干擾片段對(duì)耐藥細(xì)胞的耐藥相對(duì)逆轉(zhuǎn)率為（84.74±186）%（表3）。

2.5pU6/shRNA/mdr1重組載體對(duì)HT9細(xì)胞周期的影響

用流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)姜黃素作用48 h的各組細(xì)胞周期顯示，與HT9細(xì)胞相比，HT9/pU6/shRNA和HL60細(xì)胞周期

表2各組細(xì)胞內(nèi) Rho123的相對(duì)熒光強(qiáng)度情況

細(xì)胞1Rho123 相對(duì)應(yīng)光強(qiáng)度（%）HT9110.80±0.58aAHT9/pU6110.44±0.45aAHT9/pU6/shRNA173.56±1.37bBHL60195.13±1.12cC注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫、大寫字母表示差異顯著（P<0.05）、極顯著（P<0.01）（n=3）。下同。

發(fā)生了明顯變化，表現(xiàn)為S、G2/M期細(xì)胞增多，HT9/pU6細(xì)胞周期未發(fā)生明顯變化，說(shuō)明轉(zhuǎn)染細(xì)胞HT9/pU6/shRNA和HL60細(xì)胞周期經(jīng)姜黃素處理后阻滯在S、G2/M期（圖3）。

3結(jié)論與討論

白血病是最常見(jiàn)的造血系統(tǒng)惡性腫瘤之一，目前聯(lián)合化療仍然是白血病治療的重要措施，而白血病細(xì)胞多藥耐藥性的產(chǎn)生則使部分白血病的化療或預(yù)后最終失敗。研究表明，在經(jīng)典的白血病多藥耐藥表型中，通過(guò)對(duì)P-糖蛋白的檢測(cè)可以判斷白血病病人對(duì)當(dāng)前化療藥物是否具有抗性，以選擇恰當(dāng)?shù)闹委煼桨浮Ｄ退幠孓D(zhuǎn)劑、免疫治療、基因治療等技術(shù)已被臨床應(yīng)用于提高腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性，輔助提高腫瘤治愈率。RNA干擾技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)特異性抑制基因表達(dá)的基因治療方法，這一特異、有效的基因沉默技術(shù)現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于腫瘤多藥耐藥等方面的研究[5-6]。Yague等將設(shè)計(jì)的2對(duì)pSUPER-shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染給白血病耐藥細(xì)胞K562/ADR后，對(duì)mdr1基因表達(dá)的抑制率達(dá)95%、97%，細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性恢復(fù)至與K562細(xì)胞幾乎相同的水平[7]。Alexandra等應(yīng)用H1啟動(dòng)子介導(dǎo)的RNA干擾載體抑制胃癌EPG85-257RDB細(xì)胞mdr1基因表達(dá)，細(xì)胞耐藥逆轉(zhuǎn)率達(dá)74%[8]。

本試驗(yàn)成功構(gòu)建了RNA干擾pU6/shRNA/mdr1重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒利用RNA聚合酶Ⅲ U6啟動(dòng)子表達(dá)siRNA分子，有利于對(duì)靶基因表達(dá)受到抑制后細(xì)胞表型的長(zhǎng)期變化進(jìn)行觀察，該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HT9細(xì)胞后，構(gòu)建了長(zhǎng)期有效的基因沉默細(xì)胞模型。經(jīng)熒光定量PCR和Western檢測(cè)可知，與HT9細(xì)胞相比，單克隆細(xì)胞HT9/pU6/shRNA的 mdr1基因表達(dá)量降低了78.84%（P<0.01），P-糖蛋白表達(dá)量降低了48.27%（P<0.05），RNAi對(duì)mdr1基因的表達(dá)起到了一定的抑制作用。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)可知，轉(zhuǎn)染后的HT9細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度由10.8%±0.58%增強(qiáng)到73.5%±1.37%，因Rho123是多藥抗性細(xì)胞P-糖蛋白的底物，能被蛋白水解釋放的能量從細(xì)胞內(nèi)泵出，HT9/pU6/shRNA細(xì)胞內(nèi)Rho123熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)反映該細(xì)胞藥物外排功能減弱。轉(zhuǎn)染后，HT9細(xì)胞經(jīng)姜黃素處理的IC50由（24.10±0.83） μmol/L降至（510±0.14） μmol/L，耐藥相對(duì)逆轉(zhuǎn)率為（84.74±186）%，經(jīng)姜黃素作用48 h后，細(xì)胞周期阻滯在S、G2/M期。姜黃素的抗癌機(jī)制還未完全清楚，目前已發(fā)現(xiàn)它通過(guò)延長(zhǎng)細(xì)胞周期使細(xì)胞在S 期和（或）G2/M期集聚，達(dá)到抗增殖的作用[9-10]，在本試驗(yàn)中已得到證實(shí)。

RNAi技術(shù)可通過(guò)雙鏈短RNA（double-stranded RNA，dsRNA）觸發(fā)同源性mRNA降解[11]，目前有2種方式可以獲得雙鏈短RNA。其一，體外合成siRNA分子后采用轉(zhuǎn)染、電轉(zhuǎn)化等方法將其導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用[12]；其二，利用表達(dá)載體或siRNA表達(dá)框轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在體內(nèi)合成所需要的siRNA分子。體外合成siRNA易被降解，并需專門的RNA轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)的干擾效應(yīng)持續(xù)時(shí)間短，利用質(zhì)粒、病毒類載體介導(dǎo)的siRNA表達(dá)載體克服了以上缺點(diǎn)[13]，同時(shí)載體上的抗性標(biāo)記有助于快速篩選出轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性單克隆細(xì)胞。目前，用于表達(dá)siRNA的啟動(dòng)子有RNA聚合酶Ⅲ類啟動(dòng)子（pol Ⅲ）及RNA聚合酶Ⅱ類啟動(dòng)子（pol Ⅱ）。這些啟動(dòng)子可以在體內(nèi)高效轉(zhuǎn)錄小的、非編碼的、在5′端無(wú)帽狀結(jié)構(gòu)、在3′端無(wú)多聚腺苷酸化的轉(zhuǎn)錄本，啟動(dòng)子總是在離啟動(dòng)子一個(gè)固定距離的位置開(kāi)始轉(zhuǎn)錄合成RNA，遇到4～5個(gè)連續(xù)的U即終止，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在第2個(gè)尿嘧啶處被切下來(lái)，非常精確，從而可以限制轉(zhuǎn)錄RNA的大?。涣硗?，這類啟動(dòng)子本身序列較短，不會(huì)形成復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)。目前U6、H1啟動(dòng)子介導(dǎo)的RNAi技術(shù)已在多種腫瘤耐藥細(xì)胞中應(yīng)用[14-15]。綜上所述，利用質(zhì)粒介導(dǎo)的RNAi可以有效抑制mdr1基因編碼蛋白的表達(dá)和功能，提高耐藥細(xì)胞對(duì)姜黃素的敏感性。本研究為白血病耐藥逆轉(zhuǎn)治療提供了理論基礎(chǔ)。

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