枳殼藥材水提液HPLC指紋圖譜研究

陳 剛， 魏鴻雁， 劉江華， 石明輝， 徐曉琴

(1新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所， 烏魯木齊 830002； 2國藥集團新疆制藥有限公司， 烏魯木齊 830032)

枳殼為蕓香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培變種的干燥未成熟果實。7月果皮尚綠時采收，自中部橫切為兩半，曬干或低溫干燥[1]。枳殼因產(chǎn)地不同，有江枳殼(產(chǎn)于江西)、川枳殼、湘枳殼、蘇枳殼(江蘇、浙江產(chǎn)地)4種[2]。枳殼富含黃酮、生物堿、糖類和有機酸等成分。枳殼中的黃酮類成分主要是柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、異柚皮苷、橘紅素、川陳皮素等；生物堿類成分是辛弗林和N-甲基酪胺等。其中新橙皮苷與橙皮苷、蕓香柚皮苷(異柚皮苷)與柚皮苷分別為同分異構(gòu)體[3]。目前已有關(guān)于枳殼藥材的甲醇提取液HPLC指紋圖譜的報道[4-5]，而傳統(tǒng)的中藥是以水煎液作為主要使用方式。本研究擬建立枳殼藥材的水提液的特征指紋圖譜方法，以期為藥材質(zhì)量的評價及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1儀器美國安捷倫公司1100型液相色譜儀(美國安捷倫公司，包括四元泵、自動進樣器、柱溫箱、檢測器、工作站)，KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，BP211D電子分析天平(Sartorius CO.)。

1.2試劑柚皮苷(Naringin)、新橙皮苷(Nehesperidine)對照品由中國生物制品檢定所提供，純度>98%；異柚皮苷(isonaringin)由上海融禾醫(yī)藥科技有限公司提供，純度>98%；乙腈、甲酸為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.3藥材來源枳殼藥材樣品于2009年6-7月采自于江西省。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗色譜柱為Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.1%甲酸，流動相梯度比例見表1；檢測波長為254 nm，流速為1 mL/min，理論塔板數(shù)按柚皮苷計算應(yīng)不低于2 500。

表1 流動相梯度比例

2.2對照品溶液的制備精密稱取取柚皮苷、新橙皮苷、異柚皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL各含柚皮苷1.0 mg、新橙皮苷0.5 mg、異柚皮苷0.10 mg的溶液，即得。

2.3供試品溶液的制備取樣品中粉2 g, 精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流2 h, 放冷，再稱重，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液10 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻即得。

2.4測定方法分別吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀測定，即得。

2.5方法學考察

2.5.1 精密度試驗 取同一供試品溶液連續(xù)進樣6次，檢測指紋圖譜。結(jié)果表明，各色譜峰的相對保留時間的RSD<2%，相對峰面積的RSD<3%。采用國家藥典委員會推薦的“計算機輔助相似度評價系統(tǒng)”2004版軟件進行數(shù)據(jù)處理，相似度值>0.95，表明儀器系統(tǒng)的精密度良好，符合指紋圖譜的檢測要求。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品液分別于0、2、4、8、12、24 h檢測指紋圖譜。結(jié)果表明，各色譜峰的相對保留時間的RSD<2%，相對峰面積的RSD<3%。采用國家藥典委員會推薦的“計算機輔助相似度評價系統(tǒng)”2004版軟件進行數(shù)據(jù)處理，比較在不同時間的色譜圖，對指紋圖譜進行考察，相似度值均>0.95，符合指紋圖譜的要求，表明枳殼水提液在常溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.3 重復(fù)性試驗 取同一供試品6份，每份1 g，精密稱定，按“供試品溶液制備”的方法制備樣品。結(jié)果表明，各色譜峰的相對保留時間的RSD均<2%，相對峰面積的RSD<3%。采用國家藥典委員會推薦的“計算機輔助相似度評價系統(tǒng)”2004版軟件進行數(shù)據(jù)處理，6份樣品測得的色譜圖相比較，相似度值>0.95，符合指紋圖譜的要求。

2.5.4 指紋圖譜測定與結(jié)果分析 取不同批次的枳殼藥材，按“2.3”項下方法制備成供試液。分別取供試品溶液和對照品溶液，進樣分析，得各批次樣品的HPLC指紋圖譜。從15批藥材的指紋圖譜中共發(fā)現(xiàn)12個共有峰，通過與對照品色譜峰比對，指認出指紋圖譜中的3個特征峰，1號峰為異柚皮苷，2號峰為柚皮苷，5號峰為新橙皮苷。以5號峰為參比峰，計算12個共有峰的相對保留時間見表2，12個共有峰的相對峰面積見表3。15批枳殼藥材水提液樣品HPLC指紋圖譜和對照圖譜分別見圖1和圖2。

結(jié)果15批藥材的12個共有峰的相對保留時間的RSD值均<0.805%，說明藥材水提液的組成基本相似，且方法的穩(wěn)定性較好(表2)；15批藥材的12個共有峰的相對峰面積變化較大，其中變化最大的為9號峰，其相對峰面積RSD為196.7%，說明不同樣品中化學成分的含量變化較大(表3)。

表2 15批枳殼藥材水提液樣品HPLC指紋圖譜中12個共有峰的相對保留時間

表3 15批枳殼藥材水提液樣品HPLC指紋圖譜中12個共有峰的相對峰面積

2.5.5 樣品的相似度 采用國家藥典委員會推薦的“計算機輔助相似度評價系統(tǒng)”2004版軟件進行數(shù)據(jù)處理。該軟件的特點為可將多個色譜圖進行比較，得到多個色譜圖特征的共有模式色譜圖。再以此模式為基準，計算每個色譜圖與之獲得的對照圖譜比較相似度，采用相關(guān)系數(shù)進行評價。將15批樣品的指紋圖譜試驗數(shù)據(jù)導入中藥指紋圖譜相似度計算軟件(2004版)，通過選峰、設(shè)定匹配模式、將色譜峰自動匹配、設(shè)定標準模板選定等過程進行譜峰的差異性評價和整體相似度評價。結(jié)果表明，以對照譜圖為參照，15批樣品的相似度為0.814～0.996，說明15批藥材的相似度較好。

3 結(jié)論

本文從中藥臨床用藥特點(水煎)出發(fā)，對枳殼水提液的指紋圖譜進行研究，更加切合實際，為中藥的質(zhì)量評價提供了一種切合實際的思路。枳殼藥材中黃酮類的成分含量較高，以柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等為代表的黃酮類成分可以很好地進入水煎液中，本方法建立的枳殼水提液中黃酮類成分的特征指紋圖譜具有一定指導臨床用藥的意義。

參考文獻:

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:229-230．

[2] 王青,袁丹.不同產(chǎn)地枳實與枳殼中黃酮類成分的含量測定[J].黑龍江醫(yī)藥,2008,3(21):1-3.

[3] 潘雋麗,楊翠平,蘇薇薇.枳殼類藥材的研究概況[J].中藥材,2003,26(10):768-770.

[4] 張水寒,楊永華,蔡萍等.枳殼藥材甲醇提取物的高效液相指紋圖譜研究[J].中成藥,2006,25(10):1405-1408.

[5] 楊翠平,蘇薇薇,勞業(yè)興等.枳殼藥材HPLC指紋特征研究[J].中藥材,2003,26(6):405-408.