維藥恰麻古總黃酮對D-半乳糖致衰老小鼠氧自由基代謝的影響

解 云， 康金森， 烏 英， 海力茜·陶爾大洪

(1新疆烏魯木齊市友誼醫(yī)院藥學(xué)部， 烏魯木齊 830000； 新疆醫(yī)科大學(xué)2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 3藥學(xué)院藥分/分析教研室 ， 烏魯木齊 830011)

恰麻古植物學(xué)名為蕪菁(BrassicarapaL.)，種子植物門雙子葉植物綱十字花科(Cruciferae)蕓苔屬，蕓苔種，蕪菁亞種二年生草本植物，夏秋兩季采收。來源為十字花科植物蕪菁的干燥塊根。藥食同源，歷史悠久。恰麻古具有很高的藥用價(jià)值，始載于《名醫(yī)別錄》，味苦溫，無毒?！毒S吾爾藥志》記：性溫，開胸順氣，健胃消食，解毒；用于胸悶腹胃脹痛、食欲不振、瘡癤腫毒等疾[1]。衰老是機(jī)體各組織器官功能隨年齡的增長而發(fā)生減退和穩(wěn)態(tài)功能下降的過程。自由基學(xué)說是目前較為公認(rèn)的衰老機(jī)制理論。人體內(nèi)自身存在的谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)等抗氧化酶，均可以清除由活性氧和·OH誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化物，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性。現(xiàn)代藥理研究證明新疆恰麻古提取物具有抗炎、止咳、平喘、抗氧化等作用[2]。本研究采用D-半乳糖致衰老小鼠模型，從氧自由基代謝方面研究恰麻古總黃酮的抗衰老作用，為恰麻古總黃酮用于延緩衰老或相關(guān)疾病治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑昆明種健康小白鼠60只，雌性，體質(zhì)量18～22 g，SPF級[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(新)2011-0004，動物使用許可證號：SYXK(新)2011-0004]，由新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。D-半乳糖(美國INALCO公司原裝進(jìn)口)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國生物制品檢定所，批號：100080-200707)，SOD(批號20130705)；GSH-PX、MDA及考馬斯亮藍(lán)測定試劑盒(批號20130705)均購自南京建成生物工程研究所。其他試劑均為分析純。恰麻古藥材產(chǎn)自阿克蘇。RF-5301熒光分光光度計(jì)(日本島津)，N-101旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗)，分析天平(B-N梅特勒-上海托利多儀器有限公司)，型號AB-8、D-4020、D-101、D-141、SA-3共5種凈品級大孔吸附樹脂(天津制藥廠)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 恰麻古總黃酮提取物的制備 取恰麻古藥材粉末200 g，加75%乙醇800 mL，回流提取90 min，提取3次，過濾，合并濾液，減壓回收乙醇，加蒸餾水溶解，上D-101大孔吸附樹脂，所得流出液棄去，用蒸餾水洗去雜質(zhì)后，再用60%乙醇洗脫，洗脫液減壓回收乙醇，移至500 mL容量瓶中，即得恰麻古藥材總黃酮提取液。濃縮干燥成粉末，臨用前用蒸餾水配成所需濃度。按已確定的恰麻古藥材中總黃酮含量測定方法[3]，測得其總黃酮含量為7.57 mg/mL。

1.2.2 D-半乳糖致衰老小鼠模型的建立及給藥[4-7]將小白鼠50只均衡隨機(jī)分成5組：正常組、模型組、維生素E組及恰麻古總黃酮高、低劑量給藥組，每組10只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，常規(guī)飼料喂養(yǎng)。除空白對照組外，其余4組每日上午均頸背部皮下注射D-半乳糖150 mg/kg，造模同時(shí)，高、低劑量給藥組分別灌服恰麻古總黃酮90 、30 mg/kg，正常組和模型組灌服等容積的生理鹽水，維生素E組按100 mg/kg灌服,每日1次，連續(xù)55 d。

末次給藥24 h后，各組小鼠摘除眼球取血，4℃、3 000 r/min離心10 min制備血清；隨后頸部脫臼處死，在冰袋上快速取肝臟和腦組織，并用冰冷生理鹽水清洗后濾紙吸干，精密稱量后制成10%的組織勻漿，4℃、4 000 r /min 離心10 min，取上清液；血清和組織勻漿樣品冷凍保存于-20℃冰箱中，待測相關(guān)生化指標(biāo)。

1.2.3 生化指標(biāo)的測定 SOD的活性測定采用黃嘌呤氧化酶法，GSH-PX的活性測定采用二硫代二硝基苯甲酸法，MDA的活性測定采用TBA反應(yīng)比色法，蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)法。具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒中使用說明書上程序進(jìn)行操作。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPASS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示,組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1動物的一般體征觀察各實(shí)驗(yàn)組小鼠按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)連續(xù)處理8 w，每天除常規(guī)飼養(yǎng)外，進(jìn)行一般體征觀察。本實(shí)驗(yàn)中在連續(xù)給藥2 w后，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠嗜睡，不愛走動，進(jìn)食量減少，個(gè)別小鼠出現(xiàn)掉毛現(xiàn)象；5 w后，嗜睡明顯，長時(shí)間蜷縮不動，進(jìn)食量顯著減少，大部分小鼠均出現(xiàn)掉毛現(xiàn)象；7 w后，模型組小鼠行動明顯遲緩，毛色暗淡，體型消瘦，出現(xiàn)了明顯的衰老體征。

2.2恰麻古總黃酮對衰老小鼠腦組織中SOD、GSH-PX、MDA的影響與正常組小鼠比較，模型組小鼠腦組織中SOD、GSH-PX的活性明顯降低(P<0.05)，MDA含量明顯增高(P<0.05)，說明造模成功。與模型組小鼠比較，恰麻古總黃酮高劑量組及維生素E組小鼠腦內(nèi)SOD活性明顯增加(P<0.05)，GSH-PX活性明顯增加(P<0.05)，MDA含量明顯降低(P<0.05)；低劑量組小鼠腦內(nèi)GSH-PX明顯增加(P<0.05)，MDA含量明顯降低(P<0.05),見表1。

2.3恰麻古總黃酮對衰老小鼠肝組織中SOD、GSH-PX、MDA的影響與正常組小鼠比較，模型組小鼠肝臟中SOD、GSH-PX的活性顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著增高(P<0.05)，說明造模成功。與模型組比較，恰麻古總黃酮高、低劑量組及維生素E組衰老小鼠肝臟中SOD、GSH-PX活性明顯提高，MDA含量降低(P<0.05)，見表2。

2.4恰麻古總黃酮對衰老小鼠血清中SOD、GSH-PX、MDA的影響與正常組小鼠比較，模型組小鼠血清中SOD、GSH-PX的活性顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著增高(P<0.05)，說明造模成功。與模型組比較，恰麻古總黃酮高、低劑量組及維生素E組衰老小鼠血清中SOD、GSH-PX活性明顯提高，MDA含量降低(P<0.05)，見表3。

表1 恰麻古總黃酮對衰老小鼠腦組織SOD、GSH-PX、MDA的影響(-x±s， n=10)

注：與正常組比較,*P<0.05 ;與模型組比較,▲P<0.05。

表2 恰麻古總黃酮對衰老小鼠肝臟SOD、GSH-PX、MDA的影響(-x±s， n=10)

注：與正常組比較，*P<0.05； 與模型組比較，▲P<0.05。

表3 恰麻古總黃酮對衰老小鼠血清SOD、GSH-PX、MDA的影響(-x±s， n=10)

注：與正常組比較，*P<0.05； 與模型組比較，▲P<0.05。

3 討論

衰老是機(jī)體的生理功能逐漸下降最終走向死亡的過程，涉及機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)和器官功能的退化[8]。1956 年，Harman提出了衰老的自由基學(xué)說，他認(rèn)為衰老是由自由基引起的組織隨機(jī)毒害的結(jié)果。在人的衰老過程中，神經(jīng)元細(xì)胞膜上的不飽合脂肪酸被氧化而產(chǎn)生大量自由基，自由基可以損傷細(xì)胞膜、細(xì)胞器和酶的功能并使DNA發(fā)生突變。SOD 是體內(nèi)清除氧自由基的關(guān)鍵酶，其活性間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力；GSH-PX是機(jī)體廣泛存在的一種重要的催化H2O2分解的酶，起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整作用，從而減緩衰老過程；MDA做為自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，其水平高低是指示氧化損傷和衰老的重要標(biāo)志。

D-半乳糖致衰老模型是研究機(jī)體衰老的理想模型， 在國內(nèi)外被廣泛應(yīng)用于衰老機(jī)制、老年病及抗衰老藥物篩選等方面的研究[9-11]。本實(shí)驗(yàn)連續(xù)55 d給小鼠頸背部皮下連續(xù)注射D-半乳糖后，小鼠行動遲緩，毛色松散無光澤，自發(fā)性活動減少，且腦中SOD活力和抑制羥自由基能力比正常組均顯著下降，而MDA含量比正常組均明顯升高，說明衰老模型建立成功。本實(shí)驗(yàn)研究表明，恰麻古總黃酮可顯著提高D-半乳糖所致衰老小鼠血清、腦和肝臟組織中SOD、GSH-PX活力，降低MDA含量，說明恰麻古總黃酮可通過清除衰老小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的過多自由基，抑制機(jī)體的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，延緩正常小鼠的自然衰老進(jìn)程，具有一定的抗衰老作用。

本研究證實(shí)恰麻古總黃酮可提高體內(nèi)自由基清除酶的活性，并減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的生成，提示其具有抗氧化抗衰老作用，為將來其對和衰老相關(guān)的臨床疾病治療的開發(fā)應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。其機(jī)制尚需深入研究。

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