中藥提取液在大鼠附睪精子冷凍保存中的應(yīng)用效果

聶曉偉等

摘要：對(duì)菟絲子、淫羊藿水提液進(jìn)行分離純化，并將水提液加入大鼠精液冷凍保護(hù)劑中，對(duì)大鼠附睪尾部精子進(jìn)行冷凍保存，并評(píng)估冷凍前后精子活率指數(shù)，采用伊紅染色評(píng)估精子畸形率。結(jié)果表明：添加菟絲子、淫羊藿水提液的冷凍保護(hù)劑可以提高解凍后精子活率指數(shù)。菟絲子、淫羊藿水提液在大鼠精液冷凍保存過程中有一定的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：淫羊藿；菟絲子；大鼠；附睪精子；精子活率指數(shù)

中圖分類號(hào)： R321.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）03-0145-03

精液冷凍保存技術(shù)已有200多年的歷史。人的精液冷凍保存可以追溯到20世紀(jì)40年代末。目前，精液冷凍保存在我國(guó)主要應(yīng)用于人類精子庫，目前，已經(jīng)建立了較為成熟的精液冷凍保存體系。全國(guó)各生殖中心對(duì)人精液冷凍保護(hù)劑的需求量比較大，市場(chǎng)上人精液冷凍保存劑幾乎全部被國(guó)外的生物公司所壟斷，國(guó)內(nèi)只有部分科研院所自行配制畜禽精液冷凍保護(hù)劑，還沒有我國(guó)自行開發(fā)的人類精液冷凍保護(hù)劑應(yīng)用于臨床。筆者前期研究表明，對(duì)少弱精患者進(jìn)行精液冷凍保存，可以獲得盡可能多的處理后活動(dòng)精子總數(shù)（PTMS），并應(yīng)用于宮腔內(nèi)人工授精（IUI），使更多的患者可以接受IUI技術(shù)治療，減少治療費(fèi)用，讓不孕不育患者以最小的代價(jià)獲得妊娠[1]?，F(xiàn)有的人類精液冷凍保存系統(tǒng)適合人的正常精液。本研究探討中藥水提液對(duì)大鼠精液冷凍保存效果，旨在為冷凍保存少弱精患者精液提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

15周齡清潔級(jí)SD雄性大鼠（南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），取附睪精子用于冷凍保存研究。菟絲子（安徽井泉集團(tuán)中藥飲片有限公司），批號(hào)：20110803。淫羊藿（安徽省萬生中藥飲片有限公司），批號(hào)：20110701。2種藥材均購自江蘇省中醫(yī)院藥劑科。M16 Medium（Sigma公司），批號(hào)：11A832。

1.2 方法

1.2.1 菟絲子、淫羊藿中藥提取液的制備 取干凈菟絲子、淫羊藿各500 g，分別加8倍蒸餾水（4 000 mL）浸泡30 min，武火煮沸，文火再煮30 min，濾布過濾，濾渣再加5倍量水（2 500 mL），同上法再處理2次，各煮沸30 min，合并3次濾液。將合并的濾液旋蒸，濃縮至1 000 mL。將濃縮液置于冰箱中靜置沉淀，去除懸浮粒子（24 h）。將菟絲子濾液于70 ℃水浴中濃縮至 1 g/mL （每mL藥液相當(dāng)于1.00 g生藥量），淫羊藿濾液濃縮至 2 g/mL （每mL藥液相當(dāng)于2.00 g生藥量）。將濃縮濾液 2 500 r/min 離心20 min，取上清液 200 mL，加入等量蒸餾水稀釋后過夜，2 500 r/min離心 20 min 后再30 000 r/min高速離心20 min，提取上清液最終定量為菟絲子0.5 g/mL（每mL藥液相當(dāng)于0.50 g生藥量），淫羊藿濾液濃縮至1.00 g/mL（每mL藥液相當(dāng)于1.0 g生藥量）。將上清液經(jīng)0.45 μm濾器過濾，冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 固體物質(zhì)含量測(cè)定 取菟絲子、淫羊藿水提取液各 2 mL，置恒重的稱量瓶中，于120 ℃電熱恒溫干燥箱中干燥 3 h，使溶液緩慢揮發(fā)，直到其中的固體成分完全干燥為止，準(zhǔn)確稱量，重復(fù)2次，取平均值。溶液固含量計(jì)算見公式（1）：

固含量=干燥后固體重量/溶液總重量×100%

（1）

1.2.3 稀釋液的配制 375.0 mmol/L Tris（51.11 mg/mL）+124.0 mmol/L檸檬酸（26.06 mg/mL）+41.0 mmol/L葡萄糖（8.12 mg/mL）。50 mL稀釋液含2.555 5 g Tris+1.303 g檸檬酸+0.406 g葡萄糖。用375.0 mmol/L Tris將稀釋液的pH 值調(diào)整到7.0，用三蒸水將滲透壓調(diào)整到375 mOsm。

1.2.4 基礎(chǔ)液的配制 基礎(chǔ)液Ⅰ：M16培養(yǎng)液+50 μg/mL硫酸鏈霉素+75 μg/mL青霉素+0.1 mol/L棉籽糖+0.05% SDS+20%卵黃（95%）?；A(chǔ)液Ⅱ：首先自行配制mKRB培養(yǎng)液，配方如下：CaCl2·2H2O 1.71 mmol/L，MgSO4·7H2O 119 mmol/L。KCl 4.78 mmol/L、KH2PO4 1.19 mmol/L、NaHCO3 25.07 mmol/L、NaCl 94.6 mmol/L、葡萄糖 5.56 mmol/L、丙酮酸鈉 0.5 mmol/L、乳酸鈉 21.58 mmol/L、硫酸鏈霉素 50 μg/mL、青霉素 75 μg/mL。在mKRB培養(yǎng)液中一次性加入01 mol/L棉籽糖、005% SDS、20%卵黃。基礎(chǔ)液Ⅰ、基礎(chǔ)液Ⅱ加入卵黃后，連續(xù)混勻30 min后6 000 r/min離心30 min，取上清后再次離心30 min，用HCl調(diào)整溶液pH值為7.3，然后用 045 μm 濾膜過濾，將配制好的基礎(chǔ)液低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 試驗(yàn)分組 試驗(yàn)Ⅰ：對(duì)照組C1：PBS（5%）+基礎(chǔ)液Ⅰ（95%）；菟絲子組T1A：0.5 g/mL菟絲子提取液（1%）+PBS（4%）+基礎(chǔ)液Ⅰ（95%）；菟絲子組T1B：0.5 g/mL菟絲子提取液（2.5%）+PBS（2.5%）+基礎(chǔ)液Ⅰ（95%）；菟絲子組T1C：0.5 g/mL菟絲子提取液（5%）+基礎(chǔ)液Ⅰ（95%）。淫羊藿組Y1A：1 g/mL淫羊藿提取液（1%）+PBS（4%）+基礎(chǔ)液Ⅰ（95%）；淫羊藿組Y1B：1 g/mL淫羊藿提取液（25%）+PBS（2.5%）+基礎(chǔ)液Ⅰ（95%）；淫羊藿組Y1C：1 g/mL 淫羊藿提取液（5%）+基礎(chǔ)液Ⅰ（95%）。將大鼠精液與冷凍液按1 ∶ 1、1 ∶ 2（體積比）混合，分裝于冷凍麥管中。

試驗(yàn)Ⅱ：對(duì)照組C2：PBS（10%）+基礎(chǔ)液Ⅰ（90%）；菟絲子組T2A：0.5 g/mL菟絲子提取液（2.5%）+PBS（7.5%）+基礎(chǔ)液Ⅰ（90%）；菟絲子組T2B：0.5 g/mL菟絲子提取液（5%）+PBS（5%）+基礎(chǔ)液Ⅰ（90%）；菟絲子組T2C：0.5 g/mL 菟絲子提取液（10%）+基礎(chǔ)液Ⅰ（90%）。淫羊藿組Y2A：1 g/mL淫羊藿提取液（2.5%）+PBS（7.5%）+基礎(chǔ)液Ⅰ（90%）；淫羊藿組Y2B：1 g/mL淫羊藿提取液（5%）+PBS（5%）+基礎(chǔ)液Ⅰ（90%）；淫羊藿組Y2C：1 g/mL淫羊藿提取液（10%）+基礎(chǔ)液Ⅰ（90%）。將大鼠精液與冷凍液按 1 ∶ 1、1 ∶ 2（體積比）混合，分裝于冷凍麥管中。endprint

試驗(yàn)Ⅲ：對(duì)照組C3：基礎(chǔ)液Ⅱ；菟絲子組T3A：0.5 g/mL菟絲子提取液（0.5%）+基礎(chǔ)液Ⅱ（99.5%）；菟絲子組T3B：0.5 g/mL菟絲子提取液（1%）+基礎(chǔ)液Ⅱ（99%）；菟絲子組T3C：0.5 g/mL菟絲子提取液（1.5%）+基礎(chǔ)液Ⅱ（98.5%）。淫羊藿組Y3A：1 g/mL淫羊藿提取液（1.5%）+基礎(chǔ)液Ⅱ（98.5%）；淫羊藿組Y3B：1 g/mL淫羊藿提取液（2.5%）+基礎(chǔ)液Ⅱ（97.5%）；淫羊藿組Y3C：1 g/mL淫羊藿提取液（35%）+基礎(chǔ)液Ⅱ（96.5%）。

各組精液冷凍保護(hù)液配制完成后，均經(jīng)0.22 μm濾器過濾后備用。

1.2.6 附睪尾部精子的獲取與稀釋 每只大鼠用2 mL 10%水合氯醛腹腔麻醉后解剖，分離附睪尾，放置于盛有2 mL稀釋液的353037培養(yǎng)皿中，取附睪尾部漿液分析測(cè)定精子密度（N）、精子活率（SMI），用稀釋液將精子密度調(diào)整到2 000萬/mL備用。使用Makler計(jì)數(shù)板調(diào)整密度。

1.2.7 裝管 將精液與冷凍保護(hù)液按照1 ∶ 2（體積比）分裝于冷凍麥管和冷凍管中。

1.2.8 冷凍與解凍 將分裝好的麥管或冷凍管放入4 ℃冰箱30 min，在距離液氮表面1～2 cm的液氮蒸汽中熏蒸 10 min，然后直接投入液氮中。將冷凍麥管從液氮中取出，37 ℃ 水浴中靜置10 s，然后將凍存精液轉(zhuǎn)移到353037培養(yǎng)皿中，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 min，檢測(cè)解凍后精子活率及畸形率。將冷凍管從液氮中取出，37 ℃水浴中靜置10 min，完全解凍后檢測(cè)精子活率及畸形率。

1.2.9 精子活率測(cè)定 滴1滴精液于載玻片表面，加載蓋玻片，記錄活動(dòng)精子數(shù)、前向活動(dòng)精子數(shù)、不活動(dòng)精子數(shù)，精子活率指數(shù)計(jì)算公式如下：

2.6 菟絲子、淫羊藿水提液最佳添加濃度的確定

添加1%菟絲子提取液、2.5%淫羊藿提取液的冷凍保護(hù)劑解凍后可以見到活動(dòng)精子。添加1%菟絲子提取液（T3B）的冷凍保護(hù)劑解凍后精子活率指數(shù)最高，與其他組差異顯著；添加3.5%淫羊藿提取液（Y3C）的冷凍保護(hù)劑解凍后精子活率指數(shù)最高，但與2.5%淫羊藿提取液（Y3B）組無顯著差異。

3 結(jié)果與分析

比其他哺乳動(dòng)物精子相比，大鼠精子尾巴更加細(xì)長(zhǎng)，且頭部呈狹小細(xì)長(zhǎng)的鐮刀狀[2-3]。這些結(jié)構(gòu)上的特殊性決定其對(duì)一些環(huán)境變化極其敏感，如物理損傷、pH值變化、滲透壓變化、溫度變化等[4-5]。研究人員對(duì)大鼠精子進(jìn)行不同程度離心，結(jié)果表明，700 r/min 離心5 min 后精子活力明顯低于未離心組，離心3 次后精子質(zhì)膜完整性近乎0。因此，大鼠精子冷凍過程中應(yīng)盡量避免外界損傷。大鼠精子冷凍難度較大，主要是由于精子質(zhì)膜的脂質(zhì)含量、成分不同造成的[6]。陳蓀紅將大鼠、小鼠、人類精子在人類精子的低滲腫脹檢測(cè)液中孵育30 min 后，人類精子尾部出現(xiàn)尾間彎曲腫脹或完全腫脹，小鼠精子也出現(xiàn)類似人類精子現(xiàn)象，而大鼠精子與上述2種精子明顯不同，其尾部未出現(xiàn)任何彎曲腫脹現(xiàn)象[7]。Hammerstedt 等對(duì)不同動(dòng)物精子質(zhì)膜的磷脂成分進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)大鼠精子質(zhì)膜與牛、羊等有明顯區(qū)別，說明大鼠精子凍存難度較大與其成分特異的細(xì)胞膜有關(guān)[8]。大鼠作為體型適中的試驗(yàn)動(dòng)物被應(yīng)用于很多研究領(lǐng)域，再加上人類疾病模型的增多，需要建立成熟的保種方法。然而，大鼠精子結(jié)構(gòu)的特殊性導(dǎo)致其精子冷凍還處于探索階段，如果了解了大鼠精子細(xì)胞生物膜結(jié)構(gòu)，然后針對(duì)該特性進(jìn)行生物學(xué)機(jī)理研究，有可能取得突破性進(jìn)展，開發(fā)出適合的冷凍程序、冷凍保護(hù)劑。在以后的工作中，應(yīng)選擇菟絲子、淫羊藿、丹參等單味中藥的有效成分用于大鼠精液冷凍保存研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]聶曉偉，錢 云，劉承勇，等. 少弱精子冷凍保存在宮腔內(nèi)人工授精中的應(yīng)用[J]. 中華男科學(xué)雜志，2010，16（3）：232-235.

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[6]Parks J E，Lynch D V. Lipid composition and thermotropic phase behavior of boar，bull，stallion，and rooster sperm membranes[J]. Cryobiology，1992，29（2）：255-266.

[7]陳蓀紅. 凍存對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠配子和著床前胚胎的影響[D]. 上海：上海第二醫(yī)科大學(xué)，2002.

[8]Hammerstedt R H，Graham J K，Nolan J P. Cryopreservation of mammalian sperm：what we ask them to survive[J]. Journal of Andrology，1990，11（1）：73-88.endprint

試驗(yàn)Ⅲ：對(duì)照組C3：基礎(chǔ)液Ⅱ；菟絲子組T3A：0.5 g/mL菟絲子提取液（0.5%）+基礎(chǔ)液Ⅱ（99.5%）；菟絲子組T3B：0.5 g/mL菟絲子提取液（1%）+基礎(chǔ)液Ⅱ（99%）；菟絲子組T3C：0.5 g/mL菟絲子提取液（1.5%）+基礎(chǔ)液Ⅱ（98.5%）。淫羊藿組Y3A：1 g/mL淫羊藿提取液（1.5%）+基礎(chǔ)液Ⅱ（98.5%）；淫羊藿組Y3B：1 g/mL淫羊藿提取液（2.5%）+基礎(chǔ)液Ⅱ（97.5%）；淫羊藿組Y3C：1 g/mL淫羊藿提取液（35%）+基礎(chǔ)液Ⅱ（96.5%）。

各組精液冷凍保護(hù)液配制完成后，均經(jīng)0.22 μm濾器過濾后備用。

1.2.6 附睪尾部精子的獲取與稀釋 每只大鼠用2 mL 10%水合氯醛腹腔麻醉后解剖，分離附睪尾，放置于盛有2 mL稀釋液的353037培養(yǎng)皿中，取附睪尾部漿液分析測(cè)定精子密度（N）、精子活率（SMI），用稀釋液將精子密度調(diào)整到2 000萬/mL備用。使用Makler計(jì)數(shù)板調(diào)整密度。

1.2.7 裝管 將精液與冷凍保護(hù)液按照1 ∶ 2（體積比）分裝于冷凍麥管和冷凍管中。

1.2.8 冷凍與解凍 將分裝好的麥管或冷凍管放入4 ℃冰箱30 min，在距離液氮表面1～2 cm的液氮蒸汽中熏蒸 10 min，然后直接投入液氮中。將冷凍麥管從液氮中取出，37 ℃ 水浴中靜置10 s，然后將凍存精液轉(zhuǎn)移到353037培養(yǎng)皿中，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 min，檢測(cè)解凍后精子活率及畸形率。將冷凍管從液氮中取出，37 ℃水浴中靜置10 min，完全解凍后檢測(cè)精子活率及畸形率。

1.2.9 精子活率測(cè)定 滴1滴精液于載玻片表面，加載蓋玻片，記錄活動(dòng)精子數(shù)、前向活動(dòng)精子數(shù)、不活動(dòng)精子數(shù)，精子活率指數(shù)計(jì)算公式如下：

2.6 菟絲子、淫羊藿水提液最佳添加濃度的確定

添加1%菟絲子提取液、2.5%淫羊藿提取液的冷凍保護(hù)劑解凍后可以見到活動(dòng)精子。添加1%菟絲子提取液（T3B）的冷凍保護(hù)劑解凍后精子活率指數(shù)最高，與其他組差異顯著；添加3.5%淫羊藿提取液（Y3C）的冷凍保護(hù)劑解凍后精子活率指數(shù)最高，但與2.5%淫羊藿提取液（Y3B）組無顯著差異。

3 結(jié)果與分析

比其他哺乳動(dòng)物精子相比，大鼠精子尾巴更加細(xì)長(zhǎng)，且頭部呈狹小細(xì)長(zhǎng)的鐮刀狀[2-3]。這些結(jié)構(gòu)上的特殊性決定其對(duì)一些環(huán)境變化極其敏感，如物理損傷、pH值變化、滲透壓變化、溫度變化等[4-5]。研究人員對(duì)大鼠精子進(jìn)行不同程度離心，結(jié)果表明，700 r/min 離心5 min 后精子活力明顯低于未離心組，離心3 次后精子質(zhì)膜完整性近乎0。因此，大鼠精子冷凍過程中應(yīng)盡量避免外界損傷。大鼠精子冷凍難度較大，主要是由于精子質(zhì)膜的脂質(zhì)含量、成分不同造成的[6]。陳蓀紅將大鼠、小鼠、人類精子在人類精子的低滲腫脹檢測(cè)液中孵育30 min 后，人類精子尾部出現(xiàn)尾間彎曲腫脹或完全腫脹，小鼠精子也出現(xiàn)類似人類精子現(xiàn)象，而大鼠精子與上述2種精子明顯不同，其尾部未出現(xiàn)任何彎曲腫脹現(xiàn)象[7]。Hammerstedt 等對(duì)不同動(dòng)物精子質(zhì)膜的磷脂成分進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)大鼠精子質(zhì)膜與牛、羊等有明顯區(qū)別，說明大鼠精子凍存難度較大與其成分特異的細(xì)胞膜有關(guān)[8]。大鼠作為體型適中的試驗(yàn)動(dòng)物被應(yīng)用于很多研究領(lǐng)域，再加上人類疾病模型的增多，需要建立成熟的保種方法。然而，大鼠精子結(jié)構(gòu)的特殊性導(dǎo)致其精子冷凍還處于探索階段，如果了解了大鼠精子細(xì)胞生物膜結(jié)構(gòu)，然后針對(duì)該特性進(jìn)行生物學(xué)機(jī)理研究，有可能取得突破性進(jìn)展，開發(fā)出適合的冷凍程序、冷凍保護(hù)劑。在以后的工作中，應(yīng)選擇菟絲子、淫羊藿、丹參等單味中藥的有效成分用于大鼠精液冷凍保存研究。

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[6]Parks J E，Lynch D V. Lipid composition and thermotropic phase behavior of boar，bull，stallion，and rooster sperm membranes[J]. Cryobiology，1992，29（2）：255-266.

[7]陳蓀紅. 凍存對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠配子和著床前胚胎的影響[D]. 上海：上海第二醫(yī)科大學(xué)，2002.

[8]Hammerstedt R H，Graham J K，Nolan J P. Cryopreservation of mammalian sperm：what we ask them to survive[J]. Journal of Andrology，1990，11（1）：73-88.endprint

試驗(yàn)Ⅲ：對(duì)照組C3：基礎(chǔ)液Ⅱ；菟絲子組T3A：0.5 g/mL菟絲子提取液（0.5%）+基礎(chǔ)液Ⅱ（99.5%）；菟絲子組T3B：0.5 g/mL菟絲子提取液（1%）+基礎(chǔ)液Ⅱ（99%）；菟絲子組T3C：0.5 g/mL菟絲子提取液（1.5%）+基礎(chǔ)液Ⅱ（98.5%）。淫羊藿組Y3A：1 g/mL淫羊藿提取液（1.5%）+基礎(chǔ)液Ⅱ（98.5%）；淫羊藿組Y3B：1 g/mL淫羊藿提取液（2.5%）+基礎(chǔ)液Ⅱ（97.5%）；淫羊藿組Y3C：1 g/mL淫羊藿提取液（35%）+基礎(chǔ)液Ⅱ（96.5%）。

各組精液冷凍保護(hù)液配制完成后，均經(jīng)0.22 μm濾器過濾后備用。

1.2.6 附睪尾部精子的獲取與稀釋 每只大鼠用2 mL 10%水合氯醛腹腔麻醉后解剖，分離附睪尾，放置于盛有2 mL稀釋液的353037培養(yǎng)皿中，取附睪尾部漿液分析測(cè)定精子密度（N）、精子活率（SMI），用稀釋液將精子密度調(diào)整到2 000萬/mL備用。使用Makler計(jì)數(shù)板調(diào)整密度。

1.2.7 裝管 將精液與冷凍保護(hù)液按照1 ∶ 2（體積比）分裝于冷凍麥管和冷凍管中。

1.2.8 冷凍與解凍 將分裝好的麥管或冷凍管放入4 ℃冰箱30 min，在距離液氮表面1～2 cm的液氮蒸汽中熏蒸 10 min，然后直接投入液氮中。將冷凍麥管從液氮中取出，37 ℃ 水浴中靜置10 s，然后將凍存精液轉(zhuǎn)移到353037培養(yǎng)皿中，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 min，檢測(cè)解凍后精子活率及畸形率。將冷凍管從液氮中取出，37 ℃水浴中靜置10 min，完全解凍后檢測(cè)精子活率及畸形率。

1.2.9 精子活率測(cè)定 滴1滴精液于載玻片表面，加載蓋玻片，記錄活動(dòng)精子數(shù)、前向活動(dòng)精子數(shù)、不活動(dòng)精子數(shù)，精子活率指數(shù)計(jì)算公式如下：

2.6 菟絲子、淫羊藿水提液最佳添加濃度的確定

添加1%菟絲子提取液、2.5%淫羊藿提取液的冷凍保護(hù)劑解凍后可以見到活動(dòng)精子。添加1%菟絲子提取液（T3B）的冷凍保護(hù)劑解凍后精子活率指數(shù)最高，與其他組差異顯著；添加3.5%淫羊藿提取液（Y3C）的冷凍保護(hù)劑解凍后精子活率指數(shù)最高，但與2.5%淫羊藿提取液（Y3B）組無顯著差異。

3 結(jié)果與分析

比其他哺乳動(dòng)物精子相比，大鼠精子尾巴更加細(xì)長(zhǎng)，且頭部呈狹小細(xì)長(zhǎng)的鐮刀狀[2-3]。這些結(jié)構(gòu)上的特殊性決定其對(duì)一些環(huán)境變化極其敏感，如物理損傷、pH值變化、滲透壓變化、溫度變化等[4-5]。研究人員對(duì)大鼠精子進(jìn)行不同程度離心，結(jié)果表明，700 r/min 離心5 min 后精子活力明顯低于未離心組，離心3 次后精子質(zhì)膜完整性近乎0。因此，大鼠精子冷凍過程中應(yīng)盡量避免外界損傷。大鼠精子冷凍難度較大，主要是由于精子質(zhì)膜的脂質(zhì)含量、成分不同造成的[6]。陳蓀紅將大鼠、小鼠、人類精子在人類精子的低滲腫脹檢測(cè)液中孵育30 min 后，人類精子尾部出現(xiàn)尾間彎曲腫脹或完全腫脹，小鼠精子也出現(xiàn)類似人類精子現(xiàn)象，而大鼠精子與上述2種精子明顯不同，其尾部未出現(xiàn)任何彎曲腫脹現(xiàn)象[7]。Hammerstedt 等對(duì)不同動(dòng)物精子質(zhì)膜的磷脂成分進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)大鼠精子質(zhì)膜與牛、羊等有明顯區(qū)別，說明大鼠精子凍存難度較大與其成分特異的細(xì)胞膜有關(guān)[8]。大鼠作為體型適中的試驗(yàn)動(dòng)物被應(yīng)用于很多研究領(lǐng)域，再加上人類疾病模型的增多，需要建立成熟的保種方法。然而，大鼠精子結(jié)構(gòu)的特殊性導(dǎo)致其精子冷凍還處于探索階段，如果了解了大鼠精子細(xì)胞生物膜結(jié)構(gòu)，然后針對(duì)該特性進(jìn)行生物學(xué)機(jī)理研究，有可能取得突破性進(jìn)展，開發(fā)出適合的冷凍程序、冷凍保護(hù)劑。在以后的工作中，應(yīng)選擇菟絲子、淫羊藿、丹參等單味中藥的有效成分用于大鼠精液冷凍保存研究。

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