思茅松SRAP—PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

魏博等

摘要：對(duì)影響思茅松SRAP-PCR反應(yīng)體系的各參數(shù)進(jìn)行分析，建立并優(yōu)化出一套適合思茅松的SRAP-PCR反應(yīng)體系。在25 μL反應(yīng)體系中，模板DNA 60 ng、Mg2+2.0 mmol/L、引物1.0 μmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L、Taq DNA聚合酶1 U；在此基礎(chǔ)上，從100對(duì)引物組合中篩選出條帶清晰、多態(tài)性豐富的引物組合24對(duì)。

關(guān)鍵詞：思茅松；SRAP；體系建立；引物篩選

中圖分類(lèi)號(hào)：S722.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）03-0027-03

思茅松（Pinus kesiya var. langbianensis）是我國(guó)云南省特有樹(shù)種，以大面積純林或針闊混交林的形式集中分布于云南省思茅市、臨滄地區(qū)、紅河州、西雙版納州和德宏州的部分縣市[1]。思茅松木材廣泛用于建筑、家具制造等行業(yè)；其樹(shù)干富含樹(shù)脂、而且品質(zhì)優(yōu)良，已成為除馬尾松、濕地松之外我國(guó)重要的松脂資源。近年來(lái)，思茅松已成為云南省特別是滇南地區(qū)人工造林的主要樹(shù)種，在云南省林業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)中占有重要地位[2]。

20世紀(jì)80年代思茅松的遺傳改良工作就已經(jīng)開(kāi)展：種源試驗(yàn)及優(yōu)良林分和種源的選擇，為思茅松種子調(diào)拔區(qū)劃提供科學(xué)依據(jù)；無(wú)性繁殖技術(shù)的不斷改良，加速了思茅松良種化的進(jìn)程[3]；優(yōu)樹(shù)選擇及種子園的建立，為生產(chǎn)提供了寶貴的資源[4]。隨著分子生物學(xué)的高速發(fā)展，對(duì)思茅松的研究也從宏觀進(jìn)入了分子水平。21世紀(jì)初思茅松的遺傳多樣性在同工酶水平得到了研究，并提出了相關(guān)的遺傳資源保護(hù)策略[5]；隨后，思茅松RAPD、ISSR、AFLP等分子標(biāo)記的反應(yīng)體系相繼得以建立[6-8]。

SRAP分子標(biāo)記技術(shù)因操作方便快速、產(chǎn)率高、多態(tài)性豐富、易從條帶中得到分離條帶等特點(diǎn)已經(jīng)在植物遺傳多樣性分析、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建中得到廣泛的應(yīng)用[9-10]，但在思茅松中的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究的目的在于對(duì)思茅松的 SRAP-PCR 反應(yīng)體系的各參數(shù)進(jìn)行分析，在此基礎(chǔ)上建立和優(yōu)化一套適合思茅松的SRAP-PCR反應(yīng)體系，并篩選出適合思茅松SRAP反應(yīng)的引物組合，為思茅松的遺傳多樣性研究及遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

研究材料為云南省普洱市思茅區(qū)、景谷縣、墨江縣及孟連縣的4個(gè)思茅松自然分布群體。從每個(gè)群體中隨機(jī)采集5株長(zhǎng)勢(shì)茂盛、植株健壯的思茅松新鮮松針。采集后置于-80 ℃冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取和檢測(cè) 采用改良的CTAB法對(duì)采集樣本的基因組DNA進(jìn)行提取[11]。利用瓊脂糖凝膠電泳及核酸蛋白檢測(cè)儀2種方法對(duì)提取的思茅松DNA進(jìn)行純度和濃度的檢測(cè)。

1.2.2 引物的合成 參照Li等序列[12]，由北京華大基因科技有限公司合成引物，引物編號(hào)和序列見(jiàn)表1。

1.2.3 PCR擴(kuò)增程序 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，37 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性1 min，退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

1.2.4 SRAP-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化 在25 μL的反應(yīng)體系中模板DNA用量依次設(shè)置了30、45、60、75、90 ng 5個(gè)梯度；Mg2+濃度依次設(shè)置了1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L 5個(gè)梯度；dNTPs濃度依次設(shè)置了0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mmol/L 5個(gè)梯度；Taq DNA聚合酶用量設(shè)置了0.25、0.50、0.75、100、1.25 U 5個(gè)梯度；引物濃度依次設(shè)置了0.25、0.50、075、100、1.25 μmol/L 5個(gè)梯度。反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物用 15% 瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.5 引物篩選 利用建立的思茅松SRAP反應(yīng)體系，采用不同地區(qū)的思茅松種源對(duì)100對(duì)SRAP 引物組合（表1）進(jìn)行篩選，篩選出條帶清晰、帶型質(zhì)量好、多態(tài)性豐富的引物組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA檢測(cè)

思茅松松針中含有蛋白質(zhì)、松脂等不利DNA提取的雜質(zhì)。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明，通過(guò)改良的CTAB法基本排除了蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)的干擾，且在RNA酶作用下，將RNA也去除干凈，經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳基本能得到整齊、清晰、含雜質(zhì)較少的DNA條帶，所得DNA純度高（圖1）。核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)后，所有思茅松DNA的D260 nm/D280 nm值均在1.8～2.0之間，濃度均達(dá)到100 ng/μL以上（表2），表明其純度和濃度均能滿(mǎn)足思茅松SRAP-PCR反應(yīng)的要求。

2.2 模板DNA用量的優(yōu)化

電泳結(jié)果表明，模板DNA的用量對(duì)于PCR擴(kuò)增結(jié)果影響較大，當(dāng)模板DNA的用量小于60 ng時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)較弱，擴(kuò)增出的條帶模糊不清晰；當(dāng)模板DNA用量為60～90 ng 時(shí)，擴(kuò)增出的條帶帶型清晰、穩(wěn)定、分辨率較高（圖2）。DNA濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致模板與引物的直接配對(duì)概率降低、模板變性不徹底而引起彌散現(xiàn)象?？紤]到節(jié)約模板和試驗(yàn)操作穩(wěn)定性，在25 μL體系中DNA最佳用量為60 ng。

2.3 Mg2+濃度的優(yōu)化

試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)Mg2+濃度小于1. 5 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增出的條帶較弱、不清晰；當(dāng)Mg2+濃度大于1.5 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增出的條帶相對(duì)清晰穩(wěn)定（圖3）。但考慮到較高M(jìn)g2+濃度會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，產(chǎn)生非特異性條帶，而且會(huì)出現(xiàn)條帶不穩(wěn)定的彌散現(xiàn)象，在保證特異性PCR產(chǎn)物質(zhì)量較高、特異性較強(qiáng)的情況下，在25 μL體系中Mg2+最佳濃度為2.0 mmol/L。

2.4 dNTPs濃度的優(yōu)化

試驗(yàn)結(jié)果表明，dNTPs的濃度小于0.15 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶較弱，PCR產(chǎn)物較少，可能是因?yàn)閐NTPs過(guò)早的消耗完而使產(chǎn)物單鏈化導(dǎo)致擴(kuò)增效果不佳。當(dāng)dNTPs的濃度為 0.2 mmol/L 時(shí)，擴(kuò)增的條帶穩(wěn)定、清晰，擴(kuò)增產(chǎn)物較佳；當(dāng)濃度為0.25、0.3 mmol/L時(shí)條帶明顯增亮（圖4）。最終確定在25 μL體系中dNTPs最佳濃度為0.25 mmol/L。

2.5 Taq DNA聚合酶的優(yōu)化

試驗(yàn)結(jié)果表明，Taq DNA聚合酶用量小于0.75 U時(shí)，合成產(chǎn)物量較少，條帶擴(kuò)增不明顯；當(dāng)用量在0.75～1.25 U 之間時(shí)，擴(kuò)增的條帶明亮、清晰（圖5）?？紤]到高用量的Taq DNA聚合酶會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象，導(dǎo)致假陽(yáng)性，甚至出現(xiàn)亮的通帶，Taq DNA聚合酶用量為1 U時(shí)， 條帶最清晰穩(wěn)定、

擴(kuò)增效果最好，所以在25 μL體系中Taq DNA聚合酶最佳濃度為1 U。

2.6 引物濃度

引物的濃度在一定程度上影響擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量。結(jié)果表明：引物濃度在0.25～0.50 μmol/L之間時(shí)，其擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量較少，條帶明顯較暗。只有在1.0 μmol/L時(shí)條帶清晰穩(wěn)定，擴(kuò)增效果最好（圖6）。由于引物濃度過(guò)高會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增和錯(cuò)配，導(dǎo)致引物二聚體的產(chǎn)生，最終確定1.0 μmol/L引物濃度為最佳反應(yīng)濃度。

2.7 引物篩選

根據(jù)建立和優(yōu)化的SRAP-PCR反應(yīng)體系，采用4個(gè)群體共20個(gè)個(gè)體對(duì)100對(duì)SRAP引物組合進(jìn)行篩選，最終篩選出Me1-Em3（圖7）等24對(duì)多態(tài)性好、擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定的引物組合（表3）。

SRAP 標(biāo)記不需要知道任何基因的序列信息即可進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，具有共顯性簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，因此SRAP 技術(shù)在林木遺傳育種中得到了廣泛的應(yīng)用，并且均取得了良好的效果。SRAP分子標(biāo)記技術(shù)受到反應(yīng)條件的影響，如DNA模板、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+濃度以及反應(yīng)程序等，因此在利用SRAP分子標(biāo)記時(shí)首先應(yīng)對(duì)其反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，以保證分析結(jié)果的可靠性。本研究對(duì)PCR反應(yīng)中的各影響因子都設(shè)計(jì)了5個(gè)梯度，通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，最終確定了優(yōu)化后的思茅松SRAP反應(yīng)體系，該體系總體積為25 μL，其中模板DNA用量60 ng，Mg2+濃度2.0 mmol/L，引物1 μmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶1 U。

SRAP分子標(biāo)記多態(tài)性產(chǎn)生的原因在于上游引物與下游引物分別與外顯子區(qū)域和內(nèi)含子、啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，而內(nèi)含子和啟動(dòng)子區(qū)域在不同個(gè)體、物種中又存在差異?？梢?jiàn)，SRAP分子標(biāo)記中多態(tài)性條帶的獲得取決于引物與基因組的結(jié)合狀態(tài)。本研究建立的SRAP-PCR反應(yīng)體系，與太行菊[13]、茶樹(shù)[14]、柱花草[15]、華山松[16]等都有不同，說(shuō)明不同物種的SRAP-PCR反應(yīng)體系有一定差異。在此基礎(chǔ)上利用建立的思茅松SRAP-PCR體系成功地從100對(duì)引物組合中篩選出24對(duì)條帶清晰、多態(tài)性豐富的引物組合。表明這套思茅松SRAP-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定、可靠，為后續(xù)的思茅松遺傳多樣性研究及遺傳連鎖圖譜構(gòu)建奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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試驗(yàn)結(jié)果表明，dNTPs的濃度小于0.15 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶較弱，PCR產(chǎn)物較少，可能是因?yàn)閐NTPs過(guò)早的消耗完而使產(chǎn)物單鏈化導(dǎo)致擴(kuò)增效果不佳。當(dāng)dNTPs的濃度為 0.2 mmol/L 時(shí)，擴(kuò)增的條帶穩(wěn)定、清晰，擴(kuò)增產(chǎn)物較佳；當(dāng)濃度為0.25、0.3 mmol/L時(shí)條帶明顯增亮（圖4）。最終確定在25 μL體系中dNTPs最佳濃度為0.25 mmol/L。

2.5 Taq DNA聚合酶的優(yōu)化

試驗(yàn)結(jié)果表明，Taq DNA聚合酶用量小于0.75 U時(shí)，合成產(chǎn)物量較少，條帶擴(kuò)增不明顯；當(dāng)用量在0.75～1.25 U 之間時(shí)，擴(kuò)增的條帶明亮、清晰（圖5）。考慮到高用量的Taq DNA聚合酶會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象，導(dǎo)致假陽(yáng)性，甚至出現(xiàn)亮的通帶，Taq DNA聚合酶用量為1 U時(shí)， 條帶最清晰穩(wěn)定、

擴(kuò)增效果最好，所以在25 μL體系中Taq DNA聚合酶最佳濃度為1 U。

2.6 引物濃度

引物的濃度在一定程度上影響擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量。結(jié)果表明：引物濃度在0.25～0.50 μmol/L之間時(shí)，其擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量較少，條帶明顯較暗。只有在1.0 μmol/L時(shí)條帶清晰穩(wěn)定，擴(kuò)增效果最好（圖6）。由于引物濃度過(guò)高會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增和錯(cuò)配，導(dǎo)致引物二聚體的產(chǎn)生，最終確定1.0 μmol/L引物濃度為最佳反應(yīng)濃度。

2.7 引物篩選

根據(jù)建立和優(yōu)化的SRAP-PCR反應(yīng)體系，采用4個(gè)群體共20個(gè)個(gè)體對(duì)100對(duì)SRAP引物組合進(jìn)行篩選，最終篩選出Me1-Em3（圖7）等24對(duì)多態(tài)性好、擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定的引物組合（表3）。

SRAP 標(biāo)記不需要知道任何基因的序列信息即可進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，具有共顯性簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，因此SRAP 技術(shù)在林木遺傳育種中得到了廣泛的應(yīng)用，并且均取得了良好的效果。SRAP分子標(biāo)記技術(shù)受到反應(yīng)條件的影響，如DNA模板、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+濃度以及反應(yīng)程序等，因此在利用SRAP分子標(biāo)記時(shí)首先應(yīng)對(duì)其反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，以保證分析結(jié)果的可靠性。本研究對(duì)PCR反應(yīng)中的各影響因子都設(shè)計(jì)了5個(gè)梯度，通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，最終確定了優(yōu)化后的思茅松SRAP反應(yīng)體系，該體系總體積為25 μL，其中模板DNA用量60 ng，Mg2+濃度2.0 mmol/L，引物1 μmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶1 U。

SRAP分子標(biāo)記多態(tài)性產(chǎn)生的原因在于上游引物與下游引物分別與外顯子區(qū)域和內(nèi)含子、啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，而內(nèi)含子和啟動(dòng)子區(qū)域在不同個(gè)體、物種中又存在差異?？梢?jiàn)，SRAP分子標(biāo)記中多態(tài)性條帶的獲得取決于引物與基因組的結(jié)合狀態(tài)。本研究建立的SRAP-PCR反應(yīng)體系，與太行菊[13]、茶樹(shù)[14]、柱花草[15]、華山松[16]等都有不同，說(shuō)明不同物種的SRAP-PCR反應(yīng)體系有一定差異。在此基礎(chǔ)上利用建立的思茅松SRAP-PCR體系成功地從100對(duì)引物組合中篩選出24對(duì)條帶清晰、多態(tài)性豐富的引物組合。表明這套思茅松SRAP-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定、可靠，為后續(xù)的思茅松遺傳多樣性研究及遺傳連鎖圖譜構(gòu)建奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

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試驗(yàn)結(jié)果表明，dNTPs的濃度小于0.15 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶較弱，PCR產(chǎn)物較少，可能是因?yàn)閐NTPs過(guò)早的消耗完而使產(chǎn)物單鏈化導(dǎo)致擴(kuò)增效果不佳。當(dāng)dNTPs的濃度為 0.2 mmol/L 時(shí)，擴(kuò)增的條帶穩(wěn)定、清晰，擴(kuò)增產(chǎn)物較佳；當(dāng)濃度為0.25、0.3 mmol/L時(shí)條帶明顯增亮（圖4）。最終確定在25 μL體系中dNTPs最佳濃度為0.25 mmol/L。

2.5 Taq DNA聚合酶的優(yōu)化

試驗(yàn)結(jié)果表明，Taq DNA聚合酶用量小于0.75 U時(shí)，合成產(chǎn)物量較少，條帶擴(kuò)增不明顯；當(dāng)用量在0.75～1.25 U 之間時(shí)，擴(kuò)增的條帶明亮、清晰（圖5）。考慮到高用量的Taq DNA聚合酶會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象，導(dǎo)致假陽(yáng)性，甚至出現(xiàn)亮的通帶，Taq DNA聚合酶用量為1 U時(shí)， 條帶最清晰穩(wěn)定、

擴(kuò)增效果最好，所以在25 μL體系中Taq DNA聚合酶最佳濃度為1 U。

2.6 引物濃度

引物的濃度在一定程度上影響擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量。結(jié)果表明：引物濃度在0.25～0.50 μmol/L之間時(shí)，其擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量較少，條帶明顯較暗。只有在1.0 μmol/L時(shí)條帶清晰穩(wěn)定，擴(kuò)增效果最好（圖6）。由于引物濃度過(guò)高會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增和錯(cuò)配，導(dǎo)致引物二聚體的產(chǎn)生，最終確定1.0 μmol/L引物濃度為最佳反應(yīng)濃度。

2.7 引物篩選

根據(jù)建立和優(yōu)化的SRAP-PCR反應(yīng)體系，采用4個(gè)群體共20個(gè)個(gè)體對(duì)100對(duì)SRAP引物組合進(jìn)行篩選，最終篩選出Me1-Em3（圖7）等24對(duì)多態(tài)性好、擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定的引物組合（表3）。

SRAP 標(biāo)記不需要知道任何基因的序列信息即可進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，具有共顯性簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，因此SRAP 技術(shù)在林木遺傳育種中得到了廣泛的應(yīng)用，并且均取得了良好的效果。SRAP分子標(biāo)記技術(shù)受到反應(yīng)條件的影響，如DNA模板、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+濃度以及反應(yīng)程序等，因此在利用SRAP分子標(biāo)記時(shí)首先應(yīng)對(duì)其反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，以保證分析結(jié)果的可靠性。本研究對(duì)PCR反應(yīng)中的各影響因子都設(shè)計(jì)了5個(gè)梯度，通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，最終確定了優(yōu)化后的思茅松SRAP反應(yīng)體系，該體系總體積為25 μL，其中模板DNA用量60 ng，Mg2+濃度2.0 mmol/L，引物1 μmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶1 U。

SRAP分子標(biāo)記多態(tài)性產(chǎn)生的原因在于上游引物與下游引物分別與外顯子區(qū)域和內(nèi)含子、啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，而內(nèi)含子和啟動(dòng)子區(qū)域在不同個(gè)體、物種中又存在差異?？梢?jiàn)，SRAP分子標(biāo)記中多態(tài)性條帶的獲得取決于引物與基因組的結(jié)合狀態(tài)。本研究建立的SRAP-PCR反應(yīng)體系，與太行菊[13]、茶樹(shù)[14]、柱花草[15]、華山松[16]等都有不同，說(shuō)明不同物種的SRAP-PCR反應(yīng)體系有一定差異。在此基礎(chǔ)上利用建立的思茅松SRAP-PCR體系成功地從100對(duì)引物組合中篩選出24對(duì)條帶清晰、多態(tài)性豐富的引物組合。表明這套思茅松SRAP-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定、可靠，為后續(xù)的思茅松遺傳多樣性研究及遺傳連鎖圖譜構(gòu)建奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

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