高效液相色譜法測定香卿止痛噴霧劑中槲皮苷和丹皮酚含量*

王曙東，王 爭，劉文雅，李 克

（中國人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院，江蘇 南京 210002）

香卿止痛噴霧劑是醫(yī)院研制的以紅茴香和徐長卿為主要成分的透皮給藥噴霧制劑。紅茴香Illicium henryiDiels．為木蘭科植物，常以根或根皮入藥，槲皮苷是其主要活性組分，具有散瘀止痛、祛風(fēng)除濕等功效，常用于治療風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)痛、腰腿痛、跌打傷痛等，對急慢性腰腿痛[1]、腰肌勞損[2]、軟組織損傷[3]、梨狀肌損傷綜合征[4]等均有較好療效。徐長卿為蘿摩科植物徐長卿Cyuanchum panicalatum（Bge．）Kitag．的干燥根及根莖，具有祛風(fēng)化濕、止痛止癢等功能，常用于治療風(fēng)濕痹痛、胃痛脹滿、牙痛、腰痛、跌打損傷、蕁麻疹、濕疹等。徐長卿所含主要活性成分為丹皮酚，具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用，可使動物自發(fā)性活動減少，還具有抗菌消炎作用[5]。本試驗(yàn)中建立了用高效液相色譜法同時測定香卿止痛噴霧劑中槲皮苷和丹皮酚的分析方法。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

Waters高效液相色譜儀（1525雙泵，2487紫外檢測器，717自動進(jìn)樣器，Empower 2色譜軟件）；KQ2200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。香卿止痛噴霧劑（南京軍區(qū)南京總醫(yī)院制劑科自制，批號分別為 111220，111222，111224）；槲皮苷對照品（批號為111538－200403），丹皮酚對照品（批號為110708－200506），均來自中國藥品生物制品檢定所；甲醇為色譜純級，水為雙蒸水，其他試劑均為分析純級。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件[6－9]

色譜柱：Hedera－ODS－2 C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 －水 －冰醋酸（45∶54∶1）；檢測波長：274 nm；流速：1．0 mL ／min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；理論板數(shù)按槲皮苷和丹皮酚峰計算不低于2 000。

2．2 溶液制備

精密稱取槲皮苷、丹皮酚對照品適量，置25 mL容量瓶中，加無水乙醇定容至刻度，制成槲皮苷、丹皮酚質(zhì)量濃度分別為354．0，45．12 μg ／mL 的溶液，作為對照品貯備液。取復(fù)方噴霧劑0．7 mL，置25 mL容量瓶中，加無水乙醇適量，超聲處理30 min，放冷至室溫，加無水乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。按處方比例及制備方法，制備缺槲皮苷和丹皮酚的陰性對照品溶液。

2．3 方法學(xué)考察

干擾試驗(yàn)：取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液進(jìn)樣測定，色譜圖見圖1?？梢娫诖松V條件下，槲皮苷和丹皮酚分離度好，且陰性對照對測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：分別精密吸取槲皮苷、丹皮酚對照品溶液（354．0，45．12 μg ／mL）1，2，4，6，8，10 mL，置 25 mL 容量瓶中，以無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取20 μL，注入液相色譜儀，按2．1項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，以峰面積積分值（A）與對照品溶液質(zhì)量濃度（C）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，槲皮苷A＝2．32×107C－14 686，r＝0．999 8；丹皮酚A＝8．96×107C－42 269，r＝0．999 8。結(jié)果表明，槲皮苷與丹皮酚質(zhì)量濃度分別在35．40 ～354．00 μg／mL 和 4．51 ～45．12 μg／mL 范圍內(nèi)與其峰面積呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：取對照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，分別測定兩組分的峰面積。結(jié)果槲皮苷和丹皮酚的RSD分別為0．86%和1．37%。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密吸取同一批香卿止痛噴霧劑6份，按供試品溶液制備及測定方法平行測定兩組分的含量。結(jié)果槲皮苷和丹皮酚的RSD分別為0．53%和0．58%。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于 0，2，4，6，8，10 h 時進(jìn)樣，測定兩組分含量。結(jié)果槲皮苷和丹皮酚的RSD分別為0．91%和0．44%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：按高、中、低3個質(zhì)量濃度分別精密吸取供試品溶液 3．0，2．5，2．0 mL，共 6 份，置 5 mL 容量瓶中，分別加入對照品貯備液 1．2，1．5，1．8 mL，再加無水乙醇適量，超聲處理 30 min，放冷至室溫，加無水乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液進(jìn)樣測定。結(jié)果見表1。

2．4 樣品含量測定

精密稱取3個批號的香卿止痛噴霧劑，按供試品溶液制備及測定方法測定兩組分的峰面積，計算樣品中槲皮苷與丹皮酚的含量。結(jié)果見表2。

表1 槲皮苷和丹皮酚加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

表2 槲皮苷與丹皮酚含量測定結(jié)果（n＝3）

3 討論

經(jīng)紫外掃描，槲皮苷在波長256 nm處有最大吸收，丹皮酚最大吸收波長為274 nm，由于制劑中丹皮酚含量較槲皮苷小，且丹皮酚在波長為256 nm處的響應(yīng)值較低，不利于含量測定，故選擇丹皮酚最大吸收波長274 nm為檢測波長。

參考文獻(xiàn)，曾試用甲醇 －水 －冰醋酸（47∶52∶1，V／V／V）作流動相，槲皮苷與丹皮酚兩個主成分色譜峰不能很好分離，且拖尾現(xiàn)象較嚴(yán)重。經(jīng)試驗(yàn)，結(jié)果選用甲醇－水－冰醋酸（45∶54∶1，V／V／V），色譜峰得到較好分離，峰形也比較理想。

方法學(xué)考察表明，該方法具有良好的線性、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性，且回收率高，可對香卿止痛噴霧劑中槲皮苷和丹皮酚的含量進(jìn)行有效、準(zhǔn)確定量，對產(chǎn)品進(jìn)行有效的質(zhì)量控制。

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