大鯢熱應(yīng)激同源蛋白70 基因cDNA 克隆及表達(dá)分析

孟彥，肖漢兵，田海峰，胡喬木

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)中心，江蘇 無(wú)錫 214081)

熱休克/應(yīng)激蛋白(heat shock/stress proteins，HSPs)是廣泛存在于原核和真核生物細(xì)胞中的一類(lèi)與機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)。該蛋白在正常生理機(jī)能下有組成型表達(dá)，在受熱或其他外界環(huán)境因子(重金屬、病原體、一氧化氮、激素、微生物和抗體)刺激下可被誘導(dǎo)表達(dá)[1]。根據(jù)同源性和相對(duì)分子質(zhì)量大小，HSPs可以分為HSP110、HSP90、HSP70等不同家族，其中HSP70指相對(duì)分子質(zhì)量約為70 000的家族，是最保守、最主要的一類(lèi)HSPs，它主要可以分為2種：一種是誘導(dǎo)型HSP70，正常狀態(tài)下在細(xì)胞中不表達(dá)或少量表達(dá)，但在熱應(yīng)激或其他應(yīng)激原刺激下表達(dá)量迅速增加；另一種為組成型HSC70(heat shock cognate 70)，又稱(chēng)熱休克同源蛋白，其通常在細(xì)胞內(nèi)有組成型表達(dá)，并且能被外界刺激所誘導(dǎo)[2]。通常情況下，HSC70以分子伴侶形式參與蛋白折疊、運(yùn)轉(zhuǎn)，多肽組裝，恢復(fù)錯(cuò)誤折疊等生命過(guò)程[3]。隨著研究的深入，更多結(jié)果表明HSC70還可以作為一種激活因子，介導(dǎo)機(jī)體的免疫識(shí)別系統(tǒng)，能將結(jié)合的多肽遞呈給主要組織相容性復(fù)合物(MHC)，激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)[4]，在生物體抗逆和抗感染方面有重要作用[1]?；趯?duì)其功能的逐步認(rèn)知，多種水生動(dòng)物的hsc70 基因被克隆，比如青鳉、南方鯰、黃顙魚(yú)、大菱鲆和泥鰍等，而且開(kāi)展了對(duì)其抗逆和抗感染作用的相關(guān)研究[1]。

大鯢(Andrias davidianus)是中國(guó)重要的水生野生動(dòng)物，也是新興的名優(yōu)養(yǎng)殖水產(chǎn)品。大鯢分子生物學(xué)的相關(guān)研究較少，尤其是功能基因方面，僅見(jiàn)少數(shù)關(guān)于免疫和生長(zhǎng)相關(guān)基因的研究[5–7]。筆者對(duì)大鯢hsc70 基因cDNA全長(zhǎng)進(jìn)行克隆、對(duì)其序列進(jìn)行進(jìn)化分析，同時(shí)研究其在大鯢不同組織中的表達(dá)特征，以期為進(jìn)一步探討大鯢hsc70 可能在免疫機(jī)理及應(yīng)用等方面的作用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試大鯢

3尾變態(tài)后健康大鯢來(lái)源于中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所實(shí)驗(yàn)基地，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)暫養(yǎng)14 d后用MS–222(Sigma)進(jìn)行麻醉取樣。取腎臟、腦、肺、皮膚、肝臟、胃、脾臟、心臟、肌肉和垂體組織，置于液氮中保存。所有操作按照中國(guó)動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

1.2 總RNA 提取及第一鏈合成

大鯢組織樣品研磨后用Trizol(Invitrogen)提取總RNA，用分光光度計(jì)(Eppendorf Biometer，Germany)檢測(cè)RNA質(zhì)量。以此RNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0 (TaKaRa，Japan)合成cDNA第一鏈(具體操作見(jiàn)說(shuō)明書(shū))，–20℃保存、備用。

1.3 hsc70 基因中間序列的克隆

對(duì)GenBank 中收錄的已知物種hsc70 基因的cDNA 序列進(jìn)行同源比對(duì)，在相對(duì)保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物P1(5′–AATGAATCCCACGAACACTG–3′)和P2 (5′–ACACCTGAATCAAGACTCCA–3′)，以cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，25 μL 反應(yīng)體系，包含2.5 μL 10×PCR Buffer，2.5 μL MgCl2(25 mmol/L)，1 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，10 mmol/L 引物各0.5 μL，0.3 μL Taq 酶(5 U/μL)和 l μL cDNA 模板，ddH2O 16.7 μL。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)，72℃終延伸10min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒( AXYGEN)回收純化，連接到pMD–18T 載體(TaKaRa)，再轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a 感受態(tài)細(xì)胞，挑選克隆菌送測(cè)序。引物合成和測(cè)序均在上海生工生物有限公司進(jìn)行。

1.4 hsc70 基因cDNA 末端的克隆

根據(jù)測(cè)序后的hsc70基因中間保守序列，設(shè)計(jì)并合成用于進(jìn)行3′RACE和5′RACE特異性末端擴(kuò)增的引 物P3R(5′–CTGTTACTTGATGTCACCCC–3′) 和P5R(5′–GGTCAGCATTCAGCTCCTCAAAAC–3′)。利用試劑盒SMART RACE cDNA Amplifieation Kit (Clontech)和Advantage 2 PCR Kit(Clontech)擴(kuò)增得到大鯢hsc70基因cDNA末端序列。擴(kuò)增產(chǎn)物按上述方法回收、純化、克隆后送上海生工生物有限公司測(cè)序。

1.5 序列分析

利用序列拼接軟件SeqMan(DNASTAR6.0)將測(cè)序后的中間保守序列、3′RACE和5′RACE末端序列進(jìn)行拼接，獲得大鯢hsc70基因的cDNA全長(zhǎng)序列。序列同源性比對(duì)利用NCBI在線工具(www.ncbi.nlm. nih.gov/blast)進(jìn)行，另外利用在線工具進(jìn)行開(kāi)放閱讀框(ORF)、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、疏/親水性分析。蛋白預(yù)測(cè)分析使用ExPASy在線軟件(http://www. expasy.org/tools/)進(jìn)行；利用Mega 5.0軟件將大鯢hsc70基因編碼的氨基酸(AA)與選擇的NCBI中部分已知物種hsc70氨基酸序列做Clustal W比對(duì)并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。選擇物種包括人(Homo sapiens，Hs，NP_ 006588.1)、褐家鼠(Rattus norvegicus，Rn，NP_ 077327.1)、牛(Bos taurus，Bt，NP_776770.2)、中華鱉(Pelodiscus sinensis，Ps，NP_001273837.1)、鈍口螈(Ambystoma mexicatnum , Am，AAK31583.1)、非洲爪蟾(Xenopus laevis，Xl，NP_001080068.1)、白鰱(Hypophthalmichthys molitrix，Hm，ADH 15624.1) 、 小 體 鱘(Acipenser ruthenus ， Ar ，AEK81529.1)、泥鰍(Misgumus anguillicaudatus，Ma，AFW97631.1)和草魚(yú)(Ctenopharyngodon idella，Ci，ADX32515.1)。

1.6 hsc70 的半定量PCR

根據(jù)大鯢hsc70基因全序列，設(shè)計(jì)半定量PCR引物Hsc70–F1(5′–ATCTTGGCACCACCTACTCCT–3′)和 Hsc70–R1(5′–CAAAGACAGTGTTCGTGGGAT –3′)，擴(kuò)增該基因約177 bp的序列片段。以大鯢β–actin基因(序列號(hào)HQ822274)為內(nèi)參，利用軟件Primer 5.0 設(shè)計(jì)半定量PCR引物β–actin F1(5′–TGA TGGTTGGTATGGGACAGAA–3′)和β–actin R1(5′– CTCTTCTGGGGCAACACGGA–3′)。在S1000PCR 儀(BIO–RAD)中進(jìn)行PCR反應(yīng)，體系為25 μL，其中包 含10×PCR Buffer 2.5 μL，1 μL dNTPs(10 mmol/L)、上下游引物各1 μL(10 mmol/L)，1 μL Taq酶(5 U/μL)和 l μL cDNA模板，ddH2O 17.5 μL。其中模板為健康大鯢不同組織的cDNA第一鏈。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃終延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鯢hsc70 基因序列分析

采用RT–PCR和RACE技術(shù)克隆到大鯢hsc70基因cDNA序列全長(zhǎng)為2 284 bp，其中3′端和5′端非翻譯區(qū)分別為87 bp(1～87)和253 bp(2 032～2 284)，中間序列即編碼區(qū)長(zhǎng)1 944 bp(88～2 031)，編碼647個(gè)氨基酸(AA)；G+C含量為46%，A+T含量為54%，在3′端非翻譯區(qū)的Poly(A)尾巴上游有典型的真核細(xì)胞加尾信號(hào)(AATAAA)。GenBank登錄號(hào)為HM998289。預(yù)測(cè)編碼蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為70 748.8，理論等電點(diǎn)(PI)為5.27，分子式為C3104H4985N855O995S17。蛋白在水溶液中280 nm處的摩爾消光系數(shù)為33 600 mol/(L·cm)，不穩(wěn)定系數(shù)為35.4，不穩(wěn)定系數(shù)小于40，說(shuō)明該基因表達(dá)的蛋白屬于穩(wěn)定蛋白，并且親水/疏水指數(shù)分析結(jié)果表明為親水性蛋白。該核苷酸序列與已知兩棲類(lèi)的熱休克同源蛋白70的同源性在80%左右，如與鈍口螈(Ambystoma mexicatnum)的同源性為83.5%，與萊桑池蛙(Rana lessonea)的同源性為80.8%，與其他物種的同源性則相對(duì)較低。將其翻譯為氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因的AA序列具有熱休克蛋白家族序列標(biāo)簽IDLGTTYSCV和IVLVGGSTRIPKIQK區(qū)，分別位于AA序列9–18和334–348位的氨基酸殘基，并且在其C′端有熱休克蛋白GGMP四肽簡(jiǎn)單重復(fù)序列(615–622位)，表明所克隆的序列屬于熱休克蛋白70家族基因。

2.2 氨基酸序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

將克隆到的hsc70 基因編碼區(qū)翻譯成AA 后在NCBI 中進(jìn)行tblastn 序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與鈍口螈(Ambystoma mexicanum，Am，GI：13242237)的AA序列相似性為94%，與其他已知物種的相似性在90%左右。在NCBI 中選擇部分已知物種hsc70 氨基酸序列，與大鯢hsc70 編碼AA 比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

從圖1 中可以看出，該基因的AA 序列與分類(lèi)地位最近的鈍口螈差異最小，與其他物種的AA 序列存在較大差異，尤其在54、87、146 和501 氨基酸位點(diǎn)處，大鯢hsc70 在這4個(gè)位點(diǎn)編碼的氨基酸分別為P(脯氨酸)、G(甘氨酸)、S(絲氨酸)、S(絲氨酸)，而其他物種則為A(丙氨酸)、K(賴氨酸)、T(蘇氨酸)和M(甲硫氨酸)。

圖1 大鯢hsc70 基因AA 序列與其他物種比對(duì)結(jié)果 Fig.1 The AA sequence aligning of hsc70gene with other species

基于AA 比對(duì)結(jié)果，構(gòu)建不同物種hsc70 基因的Neighbor–Joining(NJ)和Minimum–Evolution(ME)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，得到相似的聚類(lèi)結(jié)果，圖2 為利用NJ 方法構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)。聚類(lèi)結(jié)果顯示，大鯢hsc70基因先與同屬于有尾兩棲類(lèi)的鈍口螈聚在一起，然后再與非洲爪蟾聚為一小類(lèi)，而哺乳類(lèi)的牛、人和褐家鼠聚為一起，中華鱉處于上述兩個(gè)進(jìn)化小單位的中間類(lèi)型。魚(yú)類(lèi)則形成一個(gè)大的聚類(lèi)群。這些進(jìn)化關(guān)系與其分類(lèi)關(guān)系基本一致，說(shuō)明hsc70 基因在進(jìn)化上同生物進(jìn)化是同階進(jìn)行的。

將圖2 所列11個(gè)物種的hsc70 基因cDNA 和AA 序列長(zhǎng)度與斑馬魚(yú)的相比較，結(jié)果表明，這12個(gè)物種cDNA 序列長(zhǎng)度在2 130 bp(褐家鼠)和2 770 bp(斑馬魚(yú))之間；但12個(gè)物種的hsc70 基因cDNA的AA 序列的長(zhǎng)度在646(福家鼠)～658(斑馬魚(yú))之間，說(shuō)明物種間hsc70 基因的cDNA 中間部分序列長(zhǎng)度相當(dāng)保守，而3′端和5′端非翻譯區(qū)的序列片段長(zhǎng)度差異較大。

圖2 基于NJ 法構(gòu)建的hsc70 基因氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) Fig.2 The phylogenetic tree based on amino acid sequences of hsc70gene by NJ method

2.3 hsc70 基因在組織中的表達(dá)

以大鯢β–actin 基因?yàn)閮?nèi)參，利用半定量PCR方法檢測(cè)大鯢hsc70 在正常狀態(tài)下的組織表達(dá)情況。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。hsc70 基因在10 種組織內(nèi)都以較高的水平表達(dá)，但仍然存在組織差異：在腎臟、腦、肺、皮膚、肝臟、腎臟、脾臟中表達(dá)量相對(duì)較高，在肌肉和垂體中則較低。這些表達(dá)特征與hsc70基因在草魚(yú)[8]、凡納濱對(duì)蝦[9]、泥鰍[10]等物種的表達(dá)特征基本類(lèi)似。但巖原鯉hsc70 基因在肌肉中的表達(dá)豐度大[11]，這與草魚(yú)、泥鰍以及大鯢的不同，說(shuō)明不同物種中hsc70 基因的表達(dá)有差異。

圖3 大鯢hsc70 半定量PCR 檢測(cè)結(jié)果 Fig.3 Relative quantification PCR results for hsc70 in normal tissues of Chinesegiant salamander

3 討 論

本研究克隆了大鯢的hsc70 基因cDNA 的序列全長(zhǎng)2 284 bp，發(fā)現(xiàn)其與已知部分物種hsc70 基因cDNA 核苷酸序列片段差異較大，但編碼的AA 數(shù)目在658～646，說(shuō)明hsc70 基因cDNA 序列長(zhǎng)度和其編碼蛋白的AA個(gè)數(shù)沒(méi)有明顯的相關(guān)性，核苷酸長(zhǎng)度差異主要在3′端和5′端非翻譯區(qū)。大鯢hsc70基因編碼蛋白的AA 序列與鈍口螈同源性最高(97.1%)，與牛、鼠等的同源性也達(dá)到95%左右。這說(shuō)明hsc70 基因編碼的蛋白在物種間比較保守，這與其在整個(gè)進(jìn)化史上是一個(gè)古老且保守的結(jié)論是一致的[2]。但是編碼氨基酸也存在一定的變異，特別是在54、87、146 和501 氨基酸位點(diǎn)上，大鯢與其他物種的氨基酸完全不同，進(jìn)一步分析表明大鯢在這4個(gè)位點(diǎn)的突變可能存在物種進(jìn)化上的正選擇作用。正選擇是指生物在進(jìn)化過(guò)程中將含有發(fā)生了有利突變固定下來(lái)的選擇作用，是生物對(duì)自然界的一種適應(yīng)性突變，這種突變尤其在與抗逆等相關(guān)的基因上表現(xiàn)較多[12]。大鯢作為一種古老的物種，處在水生動(dòng)物向陸生動(dòng)物過(guò)渡的階段，hsc70 也屬于抗逆相關(guān)蛋白基因，但該四個(gè)位點(diǎn)的突變是否是一種適應(yīng)性的正選擇還有待于進(jìn)一步研究驗(yàn)證。利用該基因的AA 序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明，基因的聚類(lèi)關(guān)系與物種的分類(lèi)地位是相關(guān)的，如泥鰍、白鰱、草魚(yú)聚在一類(lèi)，而兩棲類(lèi)的鈍口螈、大鯢、非洲爪蟾聚在一起，哺乳類(lèi)的牛、人和褐家鼠聚在一起。

對(duì)大鯢hsc70 基因在腎臟、腦、肺、皮膚、肝臟、腎臟、脾臟、心臟、肌肉和垂體10 種組織的表達(dá)情況分析結(jié)果顯示，盡管hsc70 基因在10 種組織內(nèi)表達(dá)豐度都較高，但仍有組織差異：垂體和肌肉表達(dá)量最少，脾臟次之，腎臟、皮膚等組織豐度最高。這些結(jié)果與其他魚(yú)類(lèi)的結(jié)果不完全相似。例如hsc70 在草魚(yú)腎臟、鰓的表達(dá)量最高，而在肌肉、小腸等表達(dá)量低[8]。在泥鰍的腸、鰓及肝組織內(nèi)hsc70 基因以較高量表達(dá)，而在肌肉、心臟則微量表達(dá)[10]。這些都表明作為一種廣泛存在于真核和原核動(dòng)物中的保守基因，hsc70 基因表達(dá)有組織普遍性，但同時(shí)也有一定的特異性。

盡管熱休克蛋白最早是在熱或者光毒性壓力刺激下產(chǎn)生而命名的[13]，但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)其在動(dòng)物免疫方面也發(fā)揮一定的作用。魚(yú)類(lèi)和甲殼動(dòng)物熱休克同源蛋白的免疫作用已有報(bào)道，該基因?qū)ξr感染白斑綜合癥過(guò)程中抵制細(xì)胞凋亡所必須的[14]；在草魚(yú)中其可以促進(jìn)免疫系統(tǒng)行使免疫應(yīng)答反應(yīng)[8]，而在近江牡蠣被溶藻弧菌感染后，該基因高度表達(dá)，參與了機(jī)體抗病原感染的相關(guān)過(guò)程[15]。目前大鯢疾病頻發(fā)[16–17]，成為制約大鯢養(yǎng)殖的主要因素之一。為了對(duì)大鯢病害防治提供研究基礎(chǔ)，促進(jìn)大鯢養(yǎng)殖業(yè)健康、持續(xù)發(fā)展，下一步將開(kāi)展熱休克同源蛋白在大鯢疾病和免疫相關(guān)方面的研究。

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