育肥豬血清中豬細小病毒16WS 株的分離與鑒定

吳海超，胡呈才，劉崇靈，李潤成，余興龍

(湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南 長沙 410128)

豬細小病毒為細小病毒科細小病毒屬成員，是一種自主型復制病毒，主要經(jīng)消化道和呼吸道傳播，廣泛存在于豬場。豬細小病毒能夠引起懷孕母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎、返情等，其中初產(chǎn)母豬癥狀最明顯[2]；還能夠引起哺乳仔豬非化膿性心肌炎[3]、仔豬皮炎[4–5]、肥育豬間質(zhì)性腎炎[6]等疾病，并能與豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus, PCV)、豬偽狂犬病(porcine pseudorabies, PRV)、豬細環(huán)病毒(Torque torque sus virus, TTSuV)[7]等多種病毒共同感染，其中與豬圓環(huán)病毒感染能夠加重仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning mμltisystemic wasting syndrome，PMWS)[8]。

1966年，Mayr[9]首次于豬瘟組織中分離到PPV病毒，Cartwright[10]等從豬流產(chǎn)胎兒中分離到該病毒并首次證明其致病作用。1982年，中國藥監(jiān)所分離到該病毒，此后在上海、黑龍江、吉林、四川、浙江等地分離到該病毒[11–12]。湖南農(nóng)業(yè)大學動物微生物與免疫實驗室從湖南一肥育早、中期生產(chǎn)成績持續(xù)較差的豬場采集了不同周齡段的小豬血清214 份，進行了豬細小病毒檢測，并從1 份血清樣品中分離到1 株豬細小病毒，對其進行了部分生物學特性研究以及部分基因序列的測序分析，具體報道如下。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病料及細胞

從湖南某豬場收集的214 份血清，其中2 周齡仔豬血清11 份；4 周齡血清10 份；6、8、9、12周齡血清各15 份；10 周齡血清17 份；14 周齡血清25 份；15 周齡血清10 份；16 周齡血清25 份；17 周齡血清10 份；18 周齡血清13 份；20 周齡血清12 份；22 周齡血清11 份；24 周齡血清10 份。豬睪丸細胞系(ST)由湖南農(nóng)業(yè)大學動物微生物與免疫實驗室保存。

1.1.2 主要試劑

DNAOUT提取試劑盒、PCR MIX 3.0 為北京天恩澤基因科技有限公司產(chǎn)品；DMEM(highglucose)培養(yǎng)基、0.25 % Trypsin–EDTA 均為HyClone 公司產(chǎn)品；新生犢牛血清為Gibco 公司產(chǎn)品；配制雙抗用青霉素鈉(80萬單位)為哈藥集團制藥總廠產(chǎn)品；配制雙抗用硫酸鏈霉素(100萬單位)為瑞陽制藥有限公司產(chǎn)品；DM2000 Plus DNA marker 為康為世紀生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方 法

1.2.1 病原檢測

從GenBank 下載多條具有代表性的豬細小病毒全基因序列，用DNAStar 軟件對全基因序列進行同源性分析，在其保守區(qū)域設(shè)計檢測引物，上游引物用PPVfp1，序列為5'–AGCGAGCCAACAACAC CAACTTT–3'；下游引物用PPVrp1，序列為5'–TCT CGGCGATCTTCTTACCTCTG–3'，退 火 溫 度 為63℃。用DNAOUT提取試劑盒提取血清中病毒基因組，以提取的DNA 為模板，進行PCR 擴增，20 μL擴增體系如下：PCR MIX 9 μL，10 pmol/L PPVfp1和PPVrp1 各0.5 μL，DNA 模板1 μL，加水補至20 μL，同時設(shè)置無模板的陰性對照。反應(yīng)條件：95℃預變性 5min；95℃變性 5min，63℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，30個循環(huán)；最后72℃延伸10min，用0.8 %的瓊脂糖對PCR 產(chǎn)物進行電泳檢測。

1.2.2 病毒分離

將其中1 份PPV 陽性血清用不含犢牛血清DMEM 培養(yǎng)基進行稀釋，稀釋總體積為1mL，稀釋梯度依次為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60。稀釋前在DMEM 培養(yǎng)基中加入1萬單位的青霉素鈉和1萬單位的硫酸鏈霉素，將稀釋好的樣品于4℃放置24 h，使青霉素和鏈霉素充分發(fā)揮作用。將生長良好的ST 細胞傳代至細胞培養(yǎng)板中，待生長密度為50%時，棄培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用0.1 mol/L PBS 洗滌2 遍后，將稀釋好的1mL 血清樣品加入至培養(yǎng)板中，設(shè)未加血清樣品的ST 細胞為陰性對照，置37℃、含5% CO2恒溫箱中孵育1 h 后，每孔加入20 μL 犢牛血清，使每孔培養(yǎng)液犢牛血清終濃度為2%，置于37℃、5% CO2恒溫箱中培養(yǎng)。對以上細胞凍融傳3 代，取第3 代細胞上清液提取DNA，并進行PCR 檢測，如能檢測到PPV 則繼續(xù)進行傳代并觀察細胞病變情況。

1.2.3 病毒血凝效價的測定

取病變穩(wěn)定后病毒液置于20℃反復凍融3次，3 000 r/min，離心4min，取50 μL，參照吳宇陽[13]介紹的方法，加入96 孔“V”型反應(yīng)板(孔中預先加入50 μL0.1 mol/L PBS)，加50 μL 0.5%豚鼠紅細胞懸液至每孔，在微量振蕩器上搖勻10 s，室溫 (25℃)下放置2 h，以出現(xiàn)50 %紅細胞凝集的最大病毒稀釋倍數(shù)視為該病毒的血凝效價。

1.2.4 PPV 分離株部分基因序列的測定及同源性分析

從GenBank 上下載多條豬細小病毒全基因序列，利用DNAStar 軟件對部分基因序列進行同源性分析，在其保守區(qū)域分段設(shè)計引物，引物信息見表1。

采用曹果清[14]介紹的飽和苯酚–氯仿抽提法對第5 代病毒液提取DNA，分別用表1 中引物對其進行PCR 擴增，50 μL PCR 擴增體系如下：PCR MIX和超純水各 23.5 μL，上下游引物各加1 μL，DNA模板1 μL。PCR 反應(yīng)條件：95℃預變性 5min 95℃變性 5min，55 /59℃ ℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。用0.8 %瓊脂糖對PCR 產(chǎn)物進行電泳檢測。將鑒定為陽性的PCR產(chǎn)物送往博尚生物有限公司進行測序，將測序結(jié)果拼接后，與GenBank 中已知序列進行比對分析，選擇的序列信息見表2。

表2 毒株信息 Table 2 Information of isolates

2 結(jié) 果

2.1 病原檢測結(jié)果

收集了湖南某豬場214 份血清，對各周齡豬血清進行PCR 病原檢測，其中2～14 周齡、24 周齡的豬血清中未檢測到PPV，15、16、17、18、22周齡的PPV 陽性檢出率分別為10%、40%、20%、15.4 %、9%。

2.2 病毒分離結(jié)果

2.2.1 細胞病變觀察

將處理好的血清接種于生長狀態(tài)良好的ST 細胞，凍融傳到第5 代，接毒細胞出現(xiàn)圓縮、脫落、拉網(wǎng)等細胞病變，而未接毒細胞形態(tài)正常，沒有出現(xiàn)細胞病變(圖1)。

圖1 分離株感染ST 細胞產(chǎn)生細胞病變 Fig1 Cytopathogenic effect induced by isolate in ST cell

2.2.2 分離病毒的PCR 鑒定

用特異性的檢測引物對本實驗PPV 分離株第5代細胞病毒液稀釋度為10–1、10–2、10–3的樣品進行PCR 檢測，結(jié)果(圖2)表明，擴增條帶與目的條帶相符，確定分離到的病毒為PPV，并將分離病毒命名為16WS。

圖2 接毒細胞的PCR 檢測結(jié)果 Fig 2 Cells inoculated with ppv detected by PCR

2.3 分離病毒對豚鼠紅細胞的血凝效價測定

取PPV陽性血清凍融傳代至第5 代的出現(xiàn)穩(wěn)定病變的細胞樣品(經(jīng)PCR 檢測為細小病毒陽性)，進行病毒凝集豚鼠紅細胞的特性的檢測，結(jié)果測出分離病毒血凝效價為28。

2.4 分離病毒的基因組序列的擴增

用豬細小病毒基因組擴增引物對第5 代細胞病毒液基因組進行PCR 擴增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果見圖3。由圖3 可見，各引物均擴增出了與預期片段大小相符的特異性條帶。

圖3 測序引物PCR 結(jié)果 Fig 3 Amplification of PPV by sequencing primers

2.5 分離病毒的基因組測序分析

將PCR 產(chǎn)物送往博尚生物有限公司進行序列測定。對序列進行拼接，序列長4 320 bp，利用DNAStar 序列分析軟件與GenBank 中10 株（毒株信息見表2）PPV 毒株進行同源性分析，結(jié)果表明分離的PPV 的基因序列與其他研究較多的豬細小病毒基因序列同源性在98 %以上，其中，與時樂[1]分離的YL 毒株同源性最高，同源性高達99.1%。

3 討 論

本實驗從一育肥豬早、中期生產(chǎn)水平較差的豬場收集了214 份血清，采用豬細小病毒特異性檢測引物進行病毒檢測，并在檢測完畢后，選取1 份陽性血清接種ST 細胞進行病毒分離，通過PCR 檢測、血凝實驗、細胞病變觀察、全基因序列測定及同源性分析等成功分離到1 株豬細小病毒。大部分的PPV 毒株都是從流產(chǎn)胎兒的肝臟、腎臟、腸系膜淋巴結(jié)、肺臟等實質(zhì)性器官分離，很少有人從育肥豬血清中進行分離。本實驗從育肥豬血清分離到1 株豬細小病毒，說明豬產(chǎn)生病毒血癥后，可以嘗試從血清中分離病毒，為采樣及分離病毒提供一種較為簡便的方法。

豬細小病毒一般在感染后的1～6 d 內(nèi)產(chǎn)生病毒血癥[15]，通過從血清中分離本病毒還可以確定該病毒是否在感染初期還是感染后期。對湖南某規(guī)模化豬場的214 份豬血清進行豬細小病毒病原檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)15、16、17、18、22 周齡均檢測到該病毒，檢測陽性率依次為10%、40%、20%、15.4%、9%，2～14 周齡及24 周齡未檢測到本病毒。針對于目前健康水平較差的豬場，豬藍耳病毒、豬偽狂犬病毒、豬細小病毒在患有呼吸道疾病及繁殖障礙性疾病的豬群中感染非常普遍，特別是豬感染豬藍耳病毒、豬偽狂犬病毒后，免疫功能被抑制，抵抗力降低，導致其他病毒乘虛而入。由于育肥豬豬細小病毒母源抗體的消失，又沒有免疫豬細小病毒疫苗，而豬場中往往又有該病毒的存在[16]，導致育肥豬前、中期容易引起豬細小病毒的感染。由于本實驗只針對于一個育肥階段生產(chǎn)較差的豬場進行了檢測，其他生產(chǎn)水平較差的豬場是否也存在這種情況還需進一步研究。

將PPV 分離株與GenBank 登錄的10 株P(guān)PV 毒株進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)PPV 分離株與其他PPV 毒株的同源性均在98%以上，其中與2012年西北農(nóng)林科技大學時樂[1]分離的YL 株同源性達到99.1%，且該分離株與德國強毒株27a、BQ 株、YL 株親緣關(guān)系較近，其他的生物學特征還需進一步研究。

[1] 時樂，黃勇，許信剛，等．豬細小病毒YL 株序列分析及其VP2 基因原核表達[J]．西北農(nóng)業(yè)學報，2012，21(6)：6–12．

[2] 韋平，秦愛建．重要動物病毒分子生物學[M]．北京：科學出版社，2008．

[3] Bolt D M，Hani H，Muller E，et al．Non-suppurative myocarditis in piglets associated with porcine parvovirus infection[J]．J Comp Pathol，1997，117(2)：107–118．

[4] 張超范，崔尚金，戚亭，等．豬細小病毒細胞適應(yīng)株的培育及鑒定[J]．中國預防獸醫(yī)學報，2008，30(5)：362–366．

[5] Choi C S，Molitor T W，Joo H S，et al．Pathogenicity of a skin isolate of porcine parvovirus in swine fetuses[J]. Vet Microbiol，1987，15(1/2)：19–29．

[6] Drolet R，D'Allaire S，Larochelle R，et al．Infectious agents identified in pigs with multifocal interstitial nephritis at slaughter[J]．The Veterinary Record，2002，150(5)：139–143．

[7] Nieto D，Aramouni M，Grau-Roma L，et al．Dynamics of Torque teno sus virus 1 (TTSuV1) and 2 (TTSuV2) DNA loads in serum of healthy and postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) affected pigs[J]．Veterinary Microbiology，2011，152(3/4)：284–290．

[8] Choi C，Chae C．Distribution of porcine parvovirus in porcine circovirus 2–infected pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome as shown by in-situ hybridization[J]．Journal of Comparative Pathology，2000，123(4)：302–305．

[9] Mayr A，Bachmann P A，Siegl G，et al．Characterization of a small porcine DNA virus[J]．Archiv frdiegesamte Virusforschung，1968，25(1)：38–51．

[10] 斯特勞．豬病學[M]．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000．

[11] 李英霞，李長宏，朱琪，等．黑龍江省豬細小病毒感染的流行病學調(diào)查[J]．中國獸醫(yī)雜志，2001，37(1)：22．

[12] 楊待建，金升藻，榮俊，等．湖北省豬細小病毒病流行的調(diào)查[J]．中國預防獸醫(yī)學報，1999，21(5)：67–70．

[13] 吳宇陽，陳龍彪，崔保安，等．豬細小病毒河南地方株HP104 的分離與生物學特性鑒定[J]．中國獸醫(yī)學報，2013，33(10)：1498–1503．

[14] 曹果清，莫清珊，陳鳳仙．酚/氯仿抽提法提取綿羊凝血塊中基因組 DNA[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學，2009，37(34)：16771–16772．

[15] 陳溥言．獸醫(yī)傳染病學[M]．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006．

[16] 王娟萍，姚敬明，丁馥香，等．豬藍耳病，豬細小病毒病和豬偽狂犬病混合感染的多重 PCR 診斷與防制[J]．養(yǎng)豬，2008(5)：70–72．