新疆阿魏藥材HPLC指紋圖譜研究

李超穎， 卿德剛，張 娟， 倪 慧， 孫 宇， 張海英， 薛 潔

(1新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 烏魯木齊 830046； 2新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所， 烏魯木齊 830002；3新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院， 烏魯木齊 830002)

新疆阿魏(FerulasinkiangensisK.M.Shen)為傘形科(Umbelliferae)阿魏屬植物，因具有蔥蒜樣臭味又名臭阿魏，是一類具有重要藥用價值的珍稀植物資源[1]。阿魏多生長于內(nèi)陸干旱荒漠地區(qū)，中國僅見于新疆西部地區(qū)?！吨袊幍洹肥蛰d的阿魏藥材為新疆阿魏或阜康阿魏的樹脂，具有消積、化癥、散痞、殺蟲等功能[2]。民間記載阿魏還用來治療神經(jīng)衰弱及腸胃不適、消化不良等疾病[3-6]。研究發(fā)現(xiàn)其具有植物雌激素活性成分[7-8]、抗癌物質(zhì)[9]及抗HIV活性物質(zhì)[10]。近年來，由于不合理采挖使得新疆阿魏的植物資源受到了毀滅性的打擊，分布面積極度萎縮，現(xiàn)為國家二級保護植物。新疆阿魏資源的嚴(yán)重破壞導(dǎo)致了國內(nèi)藥材市場上偽品、混品較多，這種狀況嚴(yán)重阻礙了新疆阿魏的開發(fā)和使用。為了更好地控制新疆阿魏藥材質(zhì)量的均勻性和穩(wěn)定性，本研究收集了不同產(chǎn)地的新疆阿魏藥材，采用高效液相色譜法，建立了新疆阿魏藥材的指紋圖譜分析方法，為新疆阿魏藥材的鑒別和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器Waters2695型高效液相色譜儀，Mettler AE163電子天平，超純水機(UPT-1-5)。

1.2材料阿魏藥材均由新疆醫(yī)科大學(xué)、新疆中藥民族藥研究所提供或由科研組在新疆伊犁拜什墩地區(qū)采集(表1)，經(jīng)新疆中藥民族藥研究所賈曉光研究員鑒定均為傘形科阿魏屬植物新疆阿魏(FerulasinkiangensisK.M.Shen)。法尼斯淝醇C(Farnesiferol C)對照品(沈陽藥科大學(xué)提供，純度≥95%，批號：54990-68-0)，液相用乙腈為色譜純，水為超純水，其它試劑均為分析純。

表1 不同批次的新疆阿魏藥材

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Waters XTerra RP18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈為流動相A，以0.01%磷酸水為流動相B，梯度洗脫：0～25 min：(40%A)，25～45 min(50%A)，45～70 min(45%A)；體積流量：1.0 mL/min；檢測波長:323 nm，柱溫：30℃；進樣量：10 μL 。

2.2溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取法尼斯淝醇C對照品1.56 mg，加甲醇溶解制成62.4 μg/mL的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取阿魏藥材約0.2 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入25 mL甲醇，精密稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，取出，待冷卻后，用甲醇補充減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.45 μm濾膜，作為供試品溶液。分別精密吸取對照溶液及供試品溶液各10 μL,注入高效液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件進行檢測，記錄70 min的色譜圖。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1 提取方法的考察 本實驗在進行方法學(xué)考察時比較了回流提取法、超聲提取法2種不同的提取方法。經(jīng)比較，2種提取方法所得色譜峰一致，超聲提取法效率較高。實驗還對不同提取溶劑、不同提取時間、不同提取次數(shù)進行了比較實驗，實驗結(jié)果表明，甲醇超聲提取30 min可基本提取完全。

2.3.2 色譜條件優(yōu)化 在色譜條件優(yōu)化過程中，對甲醇-水、乙腈-水、甲醇-酸水溶液、乙腈-酸水溶液等不同體系進行比較，結(jié)果顯示，乙腈-0.01%磷酸溶液系統(tǒng)要比其他系統(tǒng)分離度高，峰形對稱性好，基線穩(wěn)定；采用PDA檢測器對檢測波長進行了考察，記錄并比較不同波長的色譜圖，結(jié)果在323 nm檢測波長下，阿魏色譜峰較多，基線平穩(wěn)，信息豐富，故采用323 nm為檢測波長。

2.3.3 主要共有峰的選擇 本方法在檢測指認主要色譜峰時，指認出了保留時間為4.459 min的阿魏酸、47.177 min的法尼斯淝醇B和55.718 min法尼斯淝醇C，但阿魏酸占總峰面積的比例相對較小，同時又存在于很多植物中，不具備良好的代表性；法尼斯淝醇B受到雜峰干擾，基線不平，最終選擇了特征性強且可作為阿魏屬植物中特征化學(xué)成分的法尼斯淝醇C作為主要共有峰。

2.3.4 精密度試驗 取同一供試品溶液，連續(xù)進樣5次，記錄色譜峰，計算各共有峰相對保留時間及相對峰面積的RSD均<3%，保留時間和峰面積基本無明顯變化，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24、48 h檢測，記錄色譜峰，計算各共有峰相對保留時間及相對峰面積的RSD均<3%，結(jié)果表明供試品在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 重復(fù)性試驗 取同一批次阿魏藥材分別提取制備6份供試品，進行檢測，記錄色譜峰，計算各共有峰相對保留時間及相對峰面積的RSD均<3%，結(jié)果表明實驗重復(fù)性良好。

2.4樣品的測定分別精密吸取對照品溶液及供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按“2.1”項下的色譜條件進行檢測，記錄70 min的色譜圖。檢測指認，結(jié)果10批新疆阿魏藥材的指紋圖譜，與參照物法尼斯淝醇C的色譜峰相對應(yīng)的位置上有一主要色譜峰，其占總峰面積的百分比約為10%，保留時間約為55.718 min，該峰具有特征性，可作為主要共有峰(圖1)。

A：法尼斯淝醇C B：樣品圖1 新疆阿魏藥材及對照品HPLC色譜圖

2.5指紋圖譜分析同一實驗條件下，測定所有供試品HPLC色譜圖。根據(jù)不同供試品測定結(jié)果所給出的峰數(shù)、峰值(積分值)和峰位(相對保留時間)等相關(guān)參數(shù)進行分析、比較，制定優(yōu)化的指紋圖譜。通過對10批藥材的指紋圖譜進行考察，確定了18個共有峰。并對各峰的相對保留時間進行了計算(圖2、表2)。

2.6阿魏藥材指紋圖譜相似度評價分別將收集到的10批新疆阿魏藥材的色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》2004年A版相似度軟件，考察色譜峰相似度的一致性，進行相似度評價并統(tǒng)計了各批總峰數(shù)、總峰面積及共有峰與總峰面積的百分比。10批不同產(chǎn)地的新疆阿魏藥材相似度平均值為0.980，符合《中國藥典》中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究制定技術(shù)要求，所建立的新疆阿魏HPLC對照指紋圖譜合格(表3)。

S：法尼斯淝醇C； S1～S10：10批樣品圖2 10批新疆阿魏藥材指紋圖譜

表2 10批新疆阿魏藥材相對保留時間

表3 新疆阿魏藥材相似度結(jié)果

3 結(jié)論

本實驗對新疆阿魏藥材建立了HPLC法指紋圖譜，結(jié)果表明該方法穩(wěn)定、可靠且簡便，同時充分體現(xiàn)其綜合化、宏觀化等優(yōu)于其他鑒別手段的優(yōu)勢。對10批藥材進行指紋圖譜特征成分比得到了較高的相似度，說明本方法可進行新疆阿魏藥材質(zhì)量控制和藥材鑒定，為新疆阿魏藥材的合理開發(fā)和應(yīng)用提供了科學(xué)的理論依據(jù)。

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