維吾爾藥瘤果黑種草子對艾氏腹水瘤腫瘤小鼠的抗癌及抗氧化作用

艾尼娃爾·艾克木， 阿不來提·買買提明， 單蓮蓮， 王 忠，宋鳳鳳， 美麗萬·阿不都熱依木

(新疆醫(yī)科大學(xué)1藥學(xué)院分析/藥分教研室， 烏魯木齊 830011； 2第一附屬醫(yī)院泌尿外科， 烏魯木齊 830054;3教學(xué)科研條件保障中心 ,烏魯木齊 830011)

瘤果黑種草子是一種維吾爾族常用藥，又名賽拉納赫布，色雅淡，喜溫和陽光充足的環(huán)境。其具有調(diào)理胃火、助消化、固齒、抗腫瘤[1-2]及提高免疫力的作用[3]。研究報(bào)道黑種草子提取物局部給藥可延遲二甲基苯并蒽(DMBA)所致的小鼠皮膚乳頭狀癌的發(fā)生，并使腫瘤發(fā)生數(shù)減少；其水提物能抑制20-甲基膽蒽(MCA)所致的小鼠軟組織瘤的發(fā)生。

干擾素-γ(IFN-γ)主要由活化的Th細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生,其生物學(xué)功能主要是免疫調(diào)節(jié)[4-6]、誘導(dǎo)多種抗原提呈細(xì)胞表達(dá)MHC-Ⅰ/Ⅱ分子、活化單核和巨噬細(xì)胞并增強(qiáng)溶菌活性及分泌白細(xì)胞介素-1(IL-1)、6、8與TNF-a等。IFN-γ還能活化中性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞合成的黏附分子，促進(jìn)Th1細(xì)胞發(fā)育和抑制Th2細(xì)胞活化與增殖，刺激B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體類型向調(diào)理素方向轉(zhuǎn)變。過氧化脂質(zhì)(LPO)是氧自由基與多聚不飽和脂肪酸反應(yīng)的產(chǎn)物，在正常情況下,LPO的含量極低,但在病理情況下,脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)可導(dǎo)致LPO含量升高，LPO升高可對細(xì)胞及細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能造成種種損傷。 目前開展的瘤果黑種草子對荷瘤小鼠IFN-γ等指標(biāo)的影響,是檢測血清內(nèi)變化的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)觀察了瘤果黑種草子提取物口服給藥對艾氏腹水瘤生長的抑制作用及對小鼠血清IFN-γ、自然殺傷細(xì)胞(NK)、LPO等表達(dá)的影響,以期進(jìn)一步探討瘤果黑種草子抗腫瘤的作用機(jī)制,為瘤果黑種草子的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑瘤果黑種草子由新疆維吾爾民族醫(yī)院提供，環(huán)磷酰胺購于江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司(國藥準(zhǔn)字號H32020857)， Mouse IFN-γ ELISA(批號：55201019)試劑盒購于奧地利Bender Med Systems公司。NK試劑盒購于上海博舜(RD公司產(chǎn)品博舜分裝)，LPO試劑盒購于上海博舜(RD公司產(chǎn)品博舜分裝)，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(總測)購于南京建成生物工程研究所(批號：20130410)，丙二醛(MDA)試劑盒購于南京建成生物工程研究所(批號：20130409)。

1.2動(dòng)物健康昆明小鼠50只,體質(zhì)量(20±2)g,由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號：SCXK(新)2003-001]。

1.3腫瘤細(xì)胞小鼠肉瘤(EAC)購于武漢大學(xué)細(xì)胞庫。

1.4小鼠艾氏腹水瘤造模及分組50只小鼠隨機(jī)分為5組,每組10只,雌雄各半。取其中4組共40只小鼠進(jìn)行艾氏腹水瘤造模。方法:于無菌條件下抽取接種7 d的艾氏腹水瘤小鼠的腹水,為乳白色,用高壓滅菌的生理鹽水稀釋成1.0×107cfu/mL的艾氏腹水瘤腹腔積液混懸液,每只小鼠左前肢腋窩皮下接種0.2 mL,整個(gè)操作過程30 min內(nèi)完成。24 h后,根據(jù)小鼠體質(zhì)量進(jìn)行干預(yù):(1)瘤果黑種草子醇提組,給予瘤果黑種草子2 g/kg灌胃,每日1次; (2)瘤果黑種草子水提組,給予瘤果黑種草子2 g/kg灌胃,每日1次;(3)環(huán)磷酰胺(CY)組,給予CY 20 mg/kg,由第2天起,隔日腹腔注射1次; (4)模型組給予等量生理鹽水灌胃,每日1次; (5)正常組不采取任何干預(yù)措施且未接種腫瘤。實(shí)驗(yàn)期為10 d,每天稱體重,觀察小鼠的生存質(zhì)量。

1.5抑瘤率及臟器指數(shù)的測定選模后連續(xù)給藥10 d, 第10天后脫頸處死小鼠后，立即分離胸腺和脾臟,剔除周圍結(jié)締組織和脂肪,用濾紙吸干臟器表面水分,稱取質(zhì)量,計(jì)算臟器指數(shù):胸腺指數(shù)=胸腺重量(mg)/體質(zhì)量(g)；脾臟指數(shù)=脾臟重量(mg)/體質(zhì)量(g)；肝臟指數(shù)=肝臟重量(mg)/體質(zhì)量(g)。剝?nèi)×鰤K，計(jì)算抑瘤率,抑制率公式：抑瘤率=[腫瘤模型組瘤重-實(shí)驗(yàn)組瘤重]/腫瘤模型組瘤重。

1.6小鼠血清中IFN-γ、NK、LPO、SOD、MDA含量的測定造模后連續(xù)給藥10 d, 第10天后從小鼠眼眶取血，室溫下放置30 min，3 000 r/min離心20 min，取上清液，使用相應(yīng)試劑盒,按說明書方法測定小鼠血清中的IFN-γ、NK、LPO、SOD、 MDA的含量。

2 結(jié)果

2.1瘤果黑種草子對小鼠日?；顒?dòng)的影響給藥后各組艾氏腹水瘤小鼠的行為、自主活動(dòng)、攝食、飲水、毛發(fā)、糞便、尿液無改變，眼、耳、鼻、口亦未見分泌物。

2.2瘤果黑種草子對艾氏腹水瘤小鼠肉瘤生長及臟器重量的影響與模型組比較, 瘤果黑種草子醇提組、瘤果黑種草子水提組和環(huán)磷酰胺組的腫瘤重量均較小,表明有抑瘤作用。與正常組比較,環(huán)磷酰胺組的胸腺重量明顯降低；與正常組比較, 模型組、瘤果黑種草子水提組脾臟重量均明顯升高。與模型組比較,環(huán)磷酰胺組肝臟重量均明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 瘤果黑種草子對小鼠艾氏腹水瘤生長及脾臟、胸腺和肝臟重量的影響

注：與正常組比較，﹟P<0.05; 與模型組比較，*P<0.05；與環(huán)磷酰胺組比較，△P<0.05。

2.3瘤果黑種草子對艾氏腹水瘤小鼠抑瘤率及臟器指數(shù)的影響瘤果黑種草子醇提組、瘤果黑種草子水提組和環(huán)磷酰胺組的抑瘤率分別為41.73%、54.99% 和49.82%，具有明顯的抑瘤作用。與模型組比較，環(huán)磷酰胺組的胸腺指數(shù)明顯降低；與環(huán)磷酰胺組比較，瘤果黑種草子醇提組、瘤果黑種草子水提組的脾臟指數(shù)均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，瘤果黑種草子水提組的肝臟指數(shù)變化明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 瘤果黑種草子對EAC小鼠抑瘤率和主要器官指數(shù)的影響

注：與模型組比較，*P<0.05；與環(huán)磷酰胺組比較，△P<0.05。

2.4小鼠血清中SOD、MDA含量的測定結(jié)果與環(huán)磷酰胺組比較，瘤果黑種草子醇提組、瘤果黑種草子水提組血清中SOD含量均有顯著上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。瘤果黑種草子醇提組、瘤果黑種草子水提組MDA含量較環(huán)磷酰胺組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。瘤果黑種草子水提組SOD含量較模型組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3。

2.5小鼠血清中NK、IFN-γ、LPO含量測定結(jié)果與環(huán)磷酰胺組比較，瘤果黑種草子醇提組、瘤果黑種草子水提組血清中NK含量均有升高，瘤果黑種草子醇提組含量已接近正常值，瘤果黑種草子水提組與環(huán)磷酰胺組比較有顯著上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，環(huán)磷酰胺組、瘤果黑種草子醇提組、瘤果黑種草子水提組IFN-γ含量有顯著上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中瘤果黑種草子醇提組含量已接近正常值。與模型組比較，環(huán)磷酰胺組血清中LPO含量有升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，瘤果黑種草子水提組血清中LPO含量顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表4。

表3 小鼠血清中SOD、MDA含量測定

注：與模型組相比，*P<0.05；與環(huán)磷酰胺組相比，△P<0.05。

表4瘤果黑種草子對EAC小鼠血清中NK、IFN-γ、LPO指標(biāo)的影響(pg/mL, ±s)

注：與模型組比較，*P<0.05； 與環(huán)磷酰胺組比較，△P<0.05。

3 討論

自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，不僅與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)[7]，而且在某些情況下參與超敏反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)觀察瘤果黑種草子口服給藥對艾氏腹水瘤生長的抑制作用及對小鼠血清IFN、NK、 LPO表達(dá)的影響,INF-γ主要由活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生,又稱Ⅱ型干擾素,主要生物學(xué)作用為可激活巨噬細(xì)胞,增強(qiáng)多種細(xì)胞MHC分子的表達(dá),促進(jìn)Th1細(xì)胞分化及白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá),參與炎癥反應(yīng);亦具有抗病毒、抗腫瘤效應(yīng);其免疫調(diào)節(jié)活性更強(qiáng)。IL-2具有維持T細(xì)胞活化狀態(tài),參與T細(xì)胞的活化和增殖,促進(jìn)NK細(xì)胞殺傷活性、活化巨噬細(xì)胞等生物學(xué)作用。本實(shí)驗(yàn)表明瘤果黑種草子在體內(nèi)對EAC肉瘤的生長有一定的抑制作用,能夠增加免疫器官的重量。

缺氧、腫瘤等會影響機(jī)體的供能,最終會導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體的心、腦等重要器官缺血、缺氧而死亡[8-9]。瘤果黑種草子水提物抗腫瘤和抗氧化其機(jī)理有可能是由于瘤果黑種草子中的抗氧化組分能增強(qiáng)小鼠的抗應(yīng)激能力,提高對缺氧刺激的適應(yīng)能力并增強(qiáng)身體自身免疫力,以及通過調(diào)節(jié)體內(nèi)各種代謝酶的活性,降低耗氧量,清除自由基,增加抗氧化酶活性,抑制或降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng),從而抑制缺氧造成的血液流變學(xué)變性改變等來實(shí)現(xiàn)其抗氧化和抗腫瘤作用[10-12]。MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其含量的高低可反映脂質(zhì)過氧化的強(qiáng)度[13]。SOD、GSH-PX皆是評定抗氧化水平的主要生物化學(xué)指標(biāo)[14-15]。SOD是機(jī)體內(nèi)惟一能特異性地清除超氧自由基的抗氧化酶，能將過量的氧自由基歧化為過氧化氫，后者在過氧化氫酶及GSH-PX的催化下轉(zhuǎn)變?yōu)樗?，從而避免自由基對?xì)胞的損害。GSH-PX也是一種重要的抗氧化酶，它可使脂質(zhì)過氧化物還原為脂肪酸的醇類，與SOD共同組成清除自由基的防御體系[16]。在各種物理、化學(xué)、輻射等環(huán)境因素造成機(jī)體損害或誘導(dǎo)細(xì)胞突變、癌變過程中，自由基及其引發(fā)的脂質(zhì)過氧化作用起著十分重要的媒介作用，正常情況下，自由基生成與清除之間的動(dòng)態(tài)平衡是靠以SOD、GSH-PX為主的酶系統(tǒng)和非酶類抗氧化防御系統(tǒng)來維持。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，瘤果黑種草子水提物可明顯提高艾氏腹水瘤小鼠血清中的總SOD、IFN-γ、NK的含量，明顯降低小鼠血清中MDA、LPO的含量，提示瘤果黑種草子水提物能夠提高機(jī)體抗氧化酶的活力，加強(qiáng)自由基的清除，減少脂質(zhì)過氧化物MDA和LPO的產(chǎn)生。根據(jù)免疫因子和癌癥的密切關(guān)系，推斷瘤果黑種草子水提物通過體液免疫，對上述體液免疫因子進(jìn)行調(diào)控而達(dá)到抗腫瘤的作用?？鼓[瘤作用主要表現(xiàn)在艾氏腹水瘤小鼠的腫瘤腫塊體積減小、質(zhì)量減輕等。

綜上所述，本研究表明瘤果黑種草子水提物通過提高機(jī)體的抗氧化酶活力，減少脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生，拮抗DNA氧化損傷機(jī)制來實(shí)現(xiàn)其對EAC移植瘤的抗氧化作用及腫瘤的抑制作用。

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